分子生物学创新性试验开题报告

1、分子生物学创新性试验开题报告：小麦叶绿体rpoA基因的扩增及其连接转化指导教师：小组成员：学科专业：一、国内研究现状：叶绿体作为植物细胞中半自主性的细胞器，有其自身的基因组。叶绿体基因组在组织结构上高度保守，多为环状双链分子。叶绿体DN徼现于20世界60年代初期，从1986年首次获得烟草和地钱叶绿体基因组的完整序列以来，叶绿体基因组数据库迅速增加充实，至2006年底已经公布了包括生物界不同物种的叶绿体基因组数据82组，这其中包括同一个种的不同亚种。双链环状叶绿体DN砌子包括一个长单拷贝区（LSC）、一个短单拷贝区（SSC）以及两个反向重复区（IRA,IRB）。从IR区域分布的基因种类上说，此区

2、段主要分布着编码rRNA的基因以及一些功能未知的基因。在LSCffiSSCK域分布的主要是与光系统I、光系统II有关的基因，此外还包括编码Rubisco大亚基和小亚基的基因、tRNA的基因、ATPB基因、NADK体酶氧化还原酶基因和RNAIK合酶基因等。1、2而针对本次实验我们选取的则是与叶绿体RNAR合酶有关的基因ropA基因。叶绿体RN咪合酶是一种以DN©J模板合成RNA2、需的生物催化剂，是一种由多个蛋白亚基组成的复合酶，而ropA基因则是编码其a亚基的基因。通过GenBankS相关资料查询可知，普通小麦叶绿体rpoA基因全长1020bp,且序列之间无内含子结构，全序列也已公布

3、知晓。因a亚基的功能现尚未知，部分猜测认为其功能可能是识别其相应的启动子，故关于此方面的研究还在继续中。二、研究本课题的目的意义：1、掌握基础基因克隆流程及方式2、培养和提升自我的实验技能、动手能力以及优良的实验态度。3、培养融会贯通所学知识，分析问题与解决问题的能力。4、学习分子生物学综合实验设计方法。5、复习本学期所学分子生物学基础实验6、综合培养团队合作精神三、仪器试剂：1、仪器：水平式琼脂糖凝胶电泳槽、稳压电泳仪、恒温水浴锅、紫外检测仪、台式离心机、一次性刀片、恒温摇床、电热恒温培养箱超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、微量移液器、枪头盒、eppendorf管、研钵、

4、离心管等2试剂和材料：材料：小麦叶片、pEASYTM-T5ZeroCloningVector载体、E.coliDH5x单菌落试剂：回收纯化试剂盒、2XCTAB氯仿一异戊醇、异丙醇、70%乙醇、B一羟基乙醇、0.5XTE缓冲7取、RNase液氮、EB琼脂糖、TBE电泳缓冲液（pH8.0）、DNAMarker、DNAh样缓冲液：LoadingBuffer、灭菌水、凝胶DNAt断回收试剂盒、DNAl接酶、TaqDNA聚合酶、0.1mol/L的CaCl2、LB固体培养基、LB液体培养基等四、技术路线：1）、总技术路线：小麦基因组DNA1取rpoAy基因片段的PCFT增目的片段酶切取样进行琼脂糖凝胶电泳

5、检测段）琼脂糖凝胶电泳以及酶切片段的胶回收目的片段与所提供的载体连接重组子的转化涂平板（其中感受态细胞已穿插于前几步中制备完善）菌落观察及菌落PCR佥测。2）、实验原理：1、小麦基因组DNA勺提取CTABt即十六烷基三甲基澳化钱法,CTA配阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并能与核酸形成复合物，在NaCl浓度0.7mol/l时，核酸一CTABM溶，通过有机溶剂抽提和离心即可除去蛋白质、多糖和酚类。用冰乙酸或异丙醇沉淀DNA，CTA聆于乙酸或异丙醇而被除去,整个过程中液氮起维持低温环境的作用。2、目的基因的PCRT增：通过PCRT增技术，获得大量目的片段，即本实验所需要的rpoA基因片段。以提取的小麦

6、基因组DNA»模板，参考相关资料设计扩增的目的基因的上、下游引物序列，通过人工合成引物，在dNTP为主原料，DNAK合酶的催化作用下合成大量所需目的基因的过程。3、琼脂糖凝胶电泳检测PCRT物：通过查阅GenBank了解到rpoA基因全长为1020bp,由此，选用合适的DNAMarker做对比，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCRT增产物的状况好坏。4、质粒的提取：略（因本实验采用外购pEASYTM-T5ZeroCloningVector作为载体，质粒的提取可省略）5、质粒与目的基因的连接：通过用同一限制性内切酶对目的片段和待用质粒进行酶切后，通过DNA1接酶将二者连接起来形成重组质粒的过程

7、。本次实验选用外购pEASYTM-T5ZeroCloningVector作为连接载体，参考次产品的说明书获知，此质粒操作简单，无需酶切，故酶切步骤可省略。6、重组质粒的转化：即将重组质粒导入细菌。以E.coliDH5a菌株作为受体细胞，并用氯化钙处理，使其处于感受态，然后与重组质粒共保温，实现转化。由于pEASYTM-T5ZeroCloningVector带有氨苄青霉素抗性基因，可通过氨苄青霉素抗性来筛选转化子。若受体细胞没有转入质粒，则在含氨苄青霉素的培养基上不能生长，能在含氨苄青霉素培养基上生长的受体细胞肯定已成功导入了重组质粒。3)、具体实验步骤：1、CTABt液氮研磨提取小麦基因组DN

8、A(1)取1.5mlEP管，加入250屋的2XCTAB65c预热备用。(2)取小麦叶片100mg洗净、吸干、剪碎；移入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状;用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到含2XCTAB勺预热离心管中(此前离心管中加入10履0一羟基乙醇)，总体积达到500仙l;混匀后置于65c水浴4560min,并不时轻轻转动试管，使叶片粉末与CTAB试剂充分混合均匀。(3)加入等体积的氯仿一异戊醇(24:1)(大约500N1),轻轻地颠倒混匀，室温下10000r/min离心10min；用移液枪轻轻移上消至另一支新EP管中。(4)加入2倍体积冰无水乙醇(沉淀DNA,颠倒混匀，出现絮状沉淀，一

9、20放置30min；室温下12000r/min离心1055min,弃上清，回收沉淀；用70麻乙醇700屋再次清洗沉淀10min,室温下12000r/min离心2min(若有必要，还可再次重复上步清洗)；沉淀溶于50仙l0.5XTE缓冲液中，加入适量Rnase,37c水浴30min,取出于20保存，备用。2、小麦叶绿体rpoA基因的PCRT增：(1)在0.5mlEP管中按顺序加入下列试剂：10X缓冲液5屋dNTP(10mmol/l)11上下游引物各2.5屋上步提取DNA1仙1无菌水37.5仙1(2)12000r/min离心1min混合后，94水浴10min；12000r/min离心30s,使冷凝

10、水流入溶液中(3)加入0.5履TaqDNA聚合酶，混匀，12000r/min离心30s(4)在液面加5080ul石蜡油，72水浴反应5分钟(5)按下列条件于PCRZ中循环35次：94c预变性3min94变性1min，55复性2min，72延伸2min，最后一个循环延伸增加5min。随后，4c保存备用。3、PCR羊品琼脂糖凝胶电泳检测：A制胶：（1）称取0.2g琼脂糖，加入20ml的1XTBE缓冲液摇匀；（2）微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；（3）将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50）加入2ulEB后，混匀，倒入其中，直至厚度为46mm（如有气泡要把

11、气泡赶出），在室温下冷却凝固（约3045min）；（4）小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好,撤出胶槽两端胶带，将胶槽置于电泳槽中。加入0.5XTBE使液面高于胶面约1mmB电泳：（1）样品液和标准相对分子质量DNA（适宜的DNAMarker）各40仙l,加入101澳酚蓝指示剂，混匀后，用移液枪将样品加入样品孔。（2）接通电泳槽和电泳仪，注意DNAO正极移动，加样端接负极，电压为15v/cm，溴酚蓝移动到距胶版正极端约1cm时停止电泳（3）用凝胶自动成像仪拍摄凝胶结果，并进行对比。 4） DNAt段回收：紫外灯下用刀片切取DNAt断，回收试剂盒回收目的片段；4、目的片段的胶回收： 5） 1）将目标片段切下的胶转移到预先称重的1.5mleppendorf管中，称取重量，按照0.1g=100ul的体积，加入3倍体积的BufferKG； 6） 2）52度水浴5min至凝胶完全溶解，每2min震荡或涡旋混合；（3）取回收试剂盒中收集柱装在2ml收集管上，加入500ulBufferKB平衡液，10000rpm离心1min,弃去收集管中平衡液；（4）将溶解的DNA容月室700ul转移到柱子中（大于700ul分2次），10000rpm离心1min,弃去废液，将柱子套回；（5）加入7