酶联免疫吸附试验的影响因素ppt课件

1、酶联免疫吸附实验的酶联免疫吸附实验的影响要素影响要素 检验科检验科 实验过程中的影响要素终止与读数终止与读数结果的判读结果的判读试试 剂剂加加 样样温温 育育样样 本本洗洗 板板显显 色色 一、标 本 排泄物排泄物血血 清清唾唾 液液尿液、粪便尿液、粪便分泌物分泌物体体 液液血清标本血清标本脂血标本脂血标本溶血标本溶血标本标本的保管标本的保管标本的离心标本的离心采血试管采血试管 采血试管 1. 1.运用非抗凝标本血清；运用非抗凝标本血清； 肝素抗凝血浆会添加肝素抗凝血浆会添加ODOD值值;EDTA;EDTA、酶抑制剂、酶抑制剂( (如如NaN3)NaN3)可抑制可抑制ELISAELISA检测系

2、统中辣根过检测系统中辣根过氧化物酶活性氧化物酶活性; ; 2. 2.最好运用一次性玻璃试管或真空采血管最好运用一次性玻璃试管或真空采血管. . 标本采集后，应先将标本标本采集后，应先将标本3737放置放置 30-60 30-60分钟后采用分钟后采用3000r3000r /min /min离心离心15-2015-20分钟，取分钟，取 上清液加样。上清液加样。标本的离心标本的离心 标本的离心 强行离心分别血清，会使血清中仍残强行离心分别血清，会使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在留部分纤维蛋白原，在ELISAELISA测定过程中可测定过程中可以构成肉眼可见的纤维蛋白块或附着在酶以构成肉眼可见的纤维蛋白

3、块或附着在酶标板孔壁内使酶标志物不易洗掉，易呵斥标板孔壁内使酶标志物不易洗掉，易呵斥假阳阴性结果。假阳阴性结果。 标本的保管 1. 1. 一周一周 - 2 - 24 4 保管；保管； 2. 2. 超越一周超越一周 - - 建议建议-20-20保管。保管。 3. 3. 冰冻血清融解后，蛋白质会出现部分浓冰冻血清融解后，蛋白质会出现部分浓 缩而分布不均，加样前应充分混匀。缩而分布不均，加样前应充分混匀。 标本的保管 4. 混浊或有沉淀的血清标本应先离心或 过滤，廓清后再检测。 5. 作多次检测，宜少量分装冰存; 6. 血清标本宜在新颖时检测尽量防止细 菌污染。 防止细菌污染防止细菌污染 A. A.

4、如有细菌污染，菌体中能够含有内如有细菌污染，菌体中能够含有内源性的源性的 HRP HRP会产生假阳性；会产生假阳性； B. B.细菌的生长，其所分泌的一些酶能细菌的生长，其所分泌的一些酶能够会对够会对 抗原抗体等蛋白产生分解作用如抗原抗体等蛋白产生分解作用如明胶酶明胶酶 等蛋白水解酶；等蛋白水解酶； C. C.一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半半 乳糖苷酶本身会对用相应酶作标志乳糖苷酶本身会对用相应酶作标志的测定的测定 方法产生非特异性干扰。方法产生非特异性干扰。 溶血标本 1. ELISA以辣根过氧化物酶标志抗原或 抗体； 2. 红细胞破坏后可释放出大量的具有过

5、 氧化物酶活性的血红蛋白； 3. 残留的过氧化物酶催化底物产生非特 性显色导致结果假阳性。 脂血标本 1. 1. 脂质小粒粘附在反响孔内壁；脂质小粒粘附在反响孔内壁； 2. 2. 非离子型洗涤剂很难洗掉反响板上干非离子型洗涤剂很难洗掉反响板上干 扰性物质的非特异性吸附，引起吸光扰性物质的非特异性吸附，引起吸光 度度A A值升高，易呵斥假阳性结果。值升高，易呵斥假阳性结果。 餐后抽血、高甘油三脂血症患者、标本餐后抽血、高甘油三脂血症患者、标本离心时间、离心速度不适宜等，都可使分离心时间、离心速度不适宜等，都可使分别的血清标本中残留着大量的脂质小粒。别的血清标本中残留着大量的脂质小粒。 二、二、

6、试试 剂剂1.试剂盒保管于试剂盒保管于2-82.运用前应先将检测试剂运用前应先将检测试剂 盒放置室温平衡盒放置室温平衡15-30 分钟，保证酶等液体的初始反响温度及分钟，保证酶等液体的初始反响温度及 活性剂的溶解。活性剂的溶解。3.察看外包装和内组份有无漏液。察看外包装和内组份有无漏液。三、加 样仔细留意加样全部过程仔细留意加样全部过程移液器的运用移液器的运用及时放入孵育箱及时放入孵育箱标本较多时，请分批操作标本较多时，请分批操作试剂的滴加试剂的滴加 加样过程应留意： A. A. 加样不可太快；加样不可太快； B. B. 要防止加在孔壁上部；要防止加在孔壁上部； C. C. 不可溅出；不可溅出

7、； D. D. 防止产生气泡；防止产生气泡； E. E. 尽能够运用同一加样器，装紧枪尽能够运用同一加样器，装紧枪 头，加样后充分混匀。头，加样后充分混匀。 试剂的滴加 从滴瓶中滴加，应留意滴加的角度和从滴瓶中滴加，应留意滴加的角度和速度。速度。 滴加太快，很容易出现反复滴加或加滴加太快，很容易出现反复滴加或加在两孔之间的景象，这样就会在孔内的非在两孔之间的景象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。显色。移液器的运用移液的方法及本卷须知移液的方法及本卷须知枪头的装配枪头的装配量程的调理量程的调理量程的调理量程的调理 1. 1.从大体积

8、调为小体积从大体积调为小体积 2. 2.从小体积调为大体积从小体积调为大体积 在该过程中，千万不要将按钮旋出量在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否那么会卡住内部机械安装而损坏了程，否那么会卡住内部机械安装而损坏了移液枪移液枪 枪头吸液嘴的装配 用力地在枪头盒子上敲几下 错误 将移液枪器垂直插入枪头中，略微用力左右悄然转动即可使其严密结合 正确 枪头卡紧的标志是略为超越O型环，并可以看到衔接部分构成明晰的密封圈。 移液的方法移液的方法 前进移液法前进移液法 反向移液法反向移液法 普通用于转移高粘液体、生普通用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体，物活性液体、易起泡液体或极微量

9、的液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体，转移液体的时候不用吹出剩余的液体。转移液体的时候不用吹出剩余的液体。 反复操作移液法反复操作移液法 适用于快速、简便地反复转适用于快速、简便地反复转移等量的同种液体。移等量的同种液体。 全血移液法全血移液法 移液的本卷须知 1.汲取液体时，移液器坚持竖直形状，将 枪头插入液面下1厘米。 留意吸液体时，一定要缓慢平稳的松开拇指，绝不允许忽然松开，以防将溶液吸入过快而冲入移液器内腐蚀柱塞而呵斥漏气。 移液的本卷须知 2.设定加样体积，不能大于加样枪标定的 移液范围 3.加样吸嘴的干净和装配 4.汲取液体和排出液体动作都

10、一定要慢。 移液的本卷须知移液的本卷须知 5. 5.加样枪严禁汲取有强挥发性、强腐蚀性加样枪严禁汲取有强挥发性、强腐蚀性 的液体如浓酸、浓碱、有机物等的液体如浓酸、浓碱、有机物等 6. 6.不要用大量程的加样枪移取小体积的液不要用大量程的加样枪移取小体积的液 体，以免影响准确度。体，以免影响准确度。 移液的本卷须知 7.如不运用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛形状以维护弹簧，并将其竖直挂在移液枪架上。 8.外表清洁：用10%的次氯酸钠溶液或70%的酒精溶液清洁后，自然晾干。 9.微量加样枪必需按要求定期进展校准。四、温四、温 育育 1. 1. 抗原抗体反响必需在一定的抗原抗体

11、反响必需在一定的温度条件温度条件 下反响一定的时间。下反响一定的时间。2. 2. 温育所需时间与温度成反比。温育所需时间与温度成反比。3. 3. 最为常用的温育温度有最为常用的温育温度有3737和室温，和室温， 其次是其次是4343和和2 288。 实践操作中应留意： 温育温度的选择温育温度的选择足够的反响时间足够的反响时间“边缘效应的排除边缘效应的排除 温育温度的选择 1. 1.微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中 时，孔内温度从室温升至时，孔内温度从室温升至3737，需求，需求 一定的时间；一定的时间； 2. 2.在临床实验室中，通常是将微孔板一在临床实验室中，通常

12、是将微孔板一 放入温箱即开场计时，这样就很容易放入温箱即开场计时，这样就很容易 呵斥实践测定中温育时间不够，弱阳呵斥实践测定中温育时间不够，弱阳 性样本测不出来的问题。性样本测不出来的问题。 “边缘效应的排除边缘效应的排除1.1.“边缘效应，即外周孔显色较边缘效应，即外周孔显色较中心孔深中心孔深; ;2.2.有研讨证明在温育中的热力学梯有研讨证明在温育中的热力学梯度能够是度能够是 根本缘由。根本缘由。3.3.聚苯乙烯本身为不良热导体，板聚苯乙烯本身为不良热导体，板从室通从室通 常在常在2525左右置于左右置于3737温箱，温箱，板升温板升温 时，在外周孔与中心孔之间能够时，在外周孔与中心孔之间

13、能够存在一热存在一热 力学梯度。力学梯度。 总而言之，在临床总而言之，在临床ELISAELISA测定中，要测定中，要保证好的测定效果，应尽量采用水浴。保证好的测定效果，应尽量采用水浴。 温育中让微孔板浮于水面上浸入温育中让微孔板浮于水面上浸入1/31/3，或将浸透水的沙布放入一大饭盒，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中构成湿盒，然后放于温箱中，这样可使中构成湿盒，然后放于温箱中，这样可使微孔板板孔底部直接与微孔板板孔底部直接与3737水或湿布接触，水或湿布接触，而且水浴箱或湿盒内温度较高，可使反响而且水浴箱或湿盒内温度较高，可使反响溶液的温度迅速与温室平衡。溶液的温度迅速与温室平衡。 五、洗五、洗

14、 板板 血清中残留的纤维蛋白丝或血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针洗涤液析出的结晶易使洗板机针孔全阻塞或半阻塞，呵斥未结合孔全阻塞或半阻塞，呵斥未结合标志酶洗脱不彻底，导致标志酶洗脱不彻底，导致“花板花板呵斥假阳性或假阴性。呵斥假阳性或假阴性。 洗板的本卷须知1. 要有适当的浸泡时间30-60秒。2. 洗板机吸液要彻底，剩余量低于5ul。3. 洗液应调至适当的注出量，每孔应在 350ul-450ul之间，但不要溢出孔外。4.4.洗板次数应与阐明书要求一致，尽量不洗板次数应与阐明书要求一致，尽量不 要私自添加或减少洗板次数。要私自添加或减少洗板次数。5.5.稀释洗液应运用蒸馏水

15、或去离子水，稀释洗液应运用蒸馏水或去离子水，pH pH 值不宜过酸或过碱，保证配出的洗液值不宜过酸或过碱，保证配出的洗液pH pH 值为值为7.47.40.20.2，水质宜新颖，长菌或有，水质宜新颖，长菌或有 沉淀不宜运用，且用非金属容器保管。沉淀不宜运用，且用非金属容器保管。6. 6. 由于洗涤液系高浓度磷酸盐，会构成由于洗涤液系高浓度磷酸盐，会构成 结晶，配制洗液时应完全溶解。结晶，配制洗液时应完全溶解。7. 7. 稀释好的洗液稀释好的洗液44下可保管下可保管3535天。天。8. 8. 洗板后，拍干包被板，应垂直扣在备好洗板后，拍干包被板，应垂直扣在备好 的干净吸水纸或毛巾上，且每次点头应

16、的干净吸水纸或毛巾上，且每次点头应 换掉前次拍过的毛巾或吸水纸，防止交换掉前次拍过的毛巾或吸水纸，防止交 叉污染。叉污染。9. 9. 操作洗板机过程中要不时察看洗板操作洗板机过程中要不时察看洗板 机针孔内洗液的通畅情况，及时纠机针孔内洗液的通畅情况，及时纠 正，洗板机不用时运用去离子水清正，洗板机不用时运用去离子水清 洗几遍后关机。洗几遍后关机。10.10.每周要进展保养清洗。每周要进展保养清洗。 六、显 色 本卷须知：1. 检查底物溶液的有效性；2. 试剂显色时先加A液，后加B液，二者 不要颠倒。3. 前后参与的间隔时间不超越10分钟。4. 4. 假设把假设把A A液和液和B B液先混合，再

17、加样显色，液先混合，再加样显色， 需求求二者等体积混合。需求求二者等体积混合。5. A5. A、B B液应防止接触污染物。液应防止接触污染物。6. 6. 不同厂家显色液不得混用。不同厂家显色液不得混用。 七、终止和读数 肉眼判别结果时，显色浅不易察看，影响结果的准确性，必需运用酶标仪检测结果，以保证结果一致性。 本卷须知本卷须知1 1、酶标仪的波长能否适宜或滤光片能否正确。、酶标仪的波长能否适宜或滤光片能否正确。2 2、单波长或双波长比色选择的问题。、单波长或双波长比色选择的问题。 ELISA ELISA测定比色时，最好是运用双波长比色测定比色时，最好是运用双波长比色 3 3、加完终止液后、加

18、完终止液后3030分钟内读取数据。分钟内读取数据。4 4、保证酶标板的底部是清洁枯燥的。、保证酶标板的底部是清洁枯燥的。双波长比色？双波长比色？ 双波长比色测定能排除由微滴板本身、板双波长比色测定能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响，普通不用设空对特异显色测定吸光度的影响，普通不用设空白孔。白孔。 ELISA ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性；有一定程度的不确定性；在在ELISAELISA测定比色时，最好是运用双波长比色。测定比色时，最好是运用双波长比色。 八、结果的判读八、结果的判读灰区的定义灰区的定义 灰区又称灰色带反响。就是灰区又称灰色带反响。就是把把ODOD值在值在Cut offCut off值正负值正负20%20%这个这个范围内的标本称为灰区标本。这范围内的标本称为灰区标本。这个范围称为