蛋白质的性质及分离和纯化

1、第3章 蛋白质的通性、纯化和表征蛋白质的性质蛋白质的分离纯化蛋白质的性质 蛋白质的两性解离（酸碱性质） 蛋白质的胶体性质 蛋白质的变性和复性 蛋白质的紫外吸收 蛋白质的呈色反应 蛋白质的沉淀 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，如谷氨酸、天冬氨酸残基中的 和 -羧基、赖氨酸残基中的 -氨基、精氨酸残基的胍基和组氨酸残基的咪唑基，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为0，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则相反

2、。蛋白质的两性解离 体内大多数蛋白质的等电点接近pH5.0，在体液pH7.4环境下可解离成阴离子。少数蛋白质为碱性蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白等，也有少量蛋白质为酸性蛋白质，如胃蛋白和丝蛋白等。蛋白质的电泳和离子交换层析技术就是依据蛋白质的两性解离性质。蛋白质在pH值低于或高于其pI时带有电荷，在电场的作用下移动，称为电泳。由于各种分子所带电荷的多少及分子量大小不同，因而它们在电场中移动速度也不同，可用于检测、分离蛋白质。根据支持物的不同，电泳可分为薄膜电泳、凝胶电泳等，如凝胶电泳的支持物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酰胺凝胶.酸性蛋白质的等电点为酸性，碱性蛋白酸性蛋白质的等电点为酸性，碱性蛋白质的等电

3、点为碱性。质的等电点为碱性。等电点时蛋白质的特性：v溶解度最小，应用于蛋白质的分离、提纯v粘度最小v渗透压最小v膨胀性最小v导电性最小蛋白质的胶体性质 蛋白质是高分子化合物，分子直径大小为1-100 nm,属于胶粒的范围。维持蛋白质胶体溶液稳定的重要因素有两个，一是蛋白质胶体颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，形成颗粒表面水化膜；另一是蛋白质胶粒表面带有同种电荷。二者可起胶粒稳定的作用，从而阻断蛋白颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出。如除去蛋白胶粒上述两个稳定因素时，可使蛋白质从溶液中析出。在蛋白质分离中的盐吸和丙酮沉淀就是依据这一原理。另外,蛋白是生物大分子，依据不同蛋白质分子大小

4、差异,在通过有分子筛作用的凝胶时受到排除力不同，可利用透析、凝胶过滤、分子筛层析、超离心等技术分离蛋白质。由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。胶体溶液。胶体溶液的性质，如丁达尔现象、布郎运动、胶体溶液的性质，如丁达尔现象、布郎运动、电泳现象、不能通过半透膜等。电泳现象、不能通过半透膜等。蛋白质胶体稳定的因素：具有水化层，非等电蛋白质胶体稳定的因素：具有水化层，非等电点时带电荷；点时带电荷；应用：应用：利用透析法或超过滤法可纯化蛋白质：将非利用透析法或超过滤法可纯化蛋白质：将非蛋白质的小分子物质除去，蛋白质的小分子物质除去，破坏蛋白质胶体的稳

5、定的因素，可以将蛋白破坏蛋白质胶体的稳定的因素，可以将蛋白质分离质分离蛋白质的变性和复性 蛋白质在某些理化因素的作用下空间构象受到破坏,从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋白质的变性(denaturation)。变性的实质是蛋白质的天然构象受到破坏, 涉及二、三、四级结构的改变, 二硫键及各种次级键破坏，但一级结构不变，无肽键断裂.变性后由于肽键松散，面向内部的疏水基团暴露于分子表面，蛋白质分子溶解度降低并互相聚集而易于沉淀，其活性随之丧失。另外表现为粘度增加, 结晶能力消失，易被蛋白酶水解.造成蛋白质变性的因素有多种，常见的有高温、高压、紫外线和乙醇等有机溶剂、重金属离子及生物碱等。

6、在医学上，上述变性因素可导致病源微生物蛋白的变性失活，常被用来消毒灭菌。相反，在蛋白质分离纯化过程中或有效保存蛋白质时，应防止蛋白质变性。 当蛋白质变性程度较轻，可在消除变性因素条件下使蛋白质恢复或部分恢复其原有的构象和功能, 称为复性(renaturation)。但许多蛋白质或结构复杂或变性后空间构象严重破坏，不可能发生复性，称为不可逆变性。蛋白质的紫外吸收大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酸和色氨酸。这三种氨基酸在这三种氨基酸在280nm280nm 附近有最大吸收。因此，附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在大多数蛋白质在280n

7、m 280nm 附近显示强的吸收。附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定和定利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。量测定。蛋白质的呈色反应 蛋白质分子中肽键可与某些试剂发生显色反应，且产生的有色物质与蛋白质浓度相关，氨基酸则不出现此反应。此特性可用于蛋白质定性、定量检测，如双缩脲反应。蛋白质的颜色反应：双缩脲反应双缩脲反应：双缩脲在碱性溶液中与硫酸：双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称为铜反应产生红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。双缩脲反应。 蛋白质分子大小与形状蛋白质分子的大小：蛋白质分子的大小：1 110104 41 110106 6D

8、D蛋白质分子的形状：球形，纤维状、蛋白质分子的形状：球形，纤维状、椭圆形椭圆形蛋白质分子量的测定根据化学组成测分子量根据化学组成测分子量 凝胶过滤层析（分子筛层析）凝胶过滤层析（分子筛层析） SDSSDSPAGEPAGE法法超离心法超离心法渗透压法渗透压法根据化学组成测分子量 对含微量元素的蛋白质，先测定微量元素的含量，然后确定最小分子量，对含微量元素的蛋白质，先测定微量元素的含量，然后确定最小分子量，如肌红蛋白含铁为如肌红蛋白含铁为0.3350.335，其最低相对分子量为，其最低相对分子量为; ; 最低相对分子量最低相对分子量= =铁的原子量铁的原子量100/100/铁的百分含量铁的百分含量

9、 55.855.8100/0.335=16700100/0.335=16700 测定蛋白质中氨基酸含量少的氨基酸测定蛋白质中氨基酸含量少的氨基酸 凝胶过滤（分子筛层析法） 原理：蛋白质分子通过层析柱的速度并不直原理：蛋白质分子通过层析柱的速度并不直接取决于分子质量，而是它的斯托克半径，接取决于分子质量，而是它的斯托克半径，如果蛋白质与一种理想化的非水化的球状物如果蛋白质与一种理想化的非水化的球状物有相同的过柱速度，则认为两者有相同的斯有相同的过柱速度，则认为两者有相同的斯托克半径。如果用标准蛋白和待测蛋白有相托克半径。如果用标准蛋白和待测蛋白有相同的分子形状，那么用这种方法就可以测定同的分子形

10、状，那么用这种方法就可以测定蛋白质的分子量数值。蛋白质的分子量数值。logMr=a-bVelogMr=a-bVe 实验只要测得几种标准蛋白质的洗脱体积，实验只要测得几种标准蛋白质的洗脱体积，以它们的分子质量的对数对以它们的分子质量的对数对VeVe作图得一直线，作图得一直线，再测得样品的再测得样品的Ve Ve ，即可从图中确定蛋白质的，即可从图中确定蛋白质的相对分子质量相对分子质量 优点：待测样品可以不纯。优点：待测样品可以不纯。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 原理：原理： 蛋白质所带电荷和大小不同，在电场中的泳动速度各异。蛋白质所带电荷和大小不同，在电场中的泳动速度各异。 电泳系统中加入电泳系

11、统中加入SDSSDS和少量巯基乙醇，则蛋白质的泳动速度主要取决于和少量巯基乙醇，则蛋白质的泳动速度主要取决于分子量而与蛋白质本身的电荷无关。分子量而与蛋白质本身的电荷无关。 加入加入SDSSDS和少量巯基乙醇破坏了蛋白质的原有的高级结构，有四级结构和少量巯基乙醇破坏了蛋白质的原有的高级结构，有四级结构的蛋白质也都解离为亚基，且蛋白质都变为椭圆状，并带上大量的负电的蛋白质也都解离为亚基，且蛋白质都变为椭圆状，并带上大量的负电荷，电荷的多少只与蛋白质多肽链的分子大小成正比。荷，电荷的多少只与蛋白质多肽链的分子大小成正比。 蛋白质的电泳迁移率与其分子量的对数呈线性关系。蛋白质的电泳迁移率与其分子量的

12、对数呈线性关系。 电泳迁移率电泳迁移率= = 蛋白质移动距离蛋白质移动距离/ /示踪示踪小分子移动距离。小分子移动距离。 用已知分子量的蛋白质制得标准曲线，在同样条件下测出未知蛋白质的迁移用已知分子量的蛋白质制得标准曲线，在同样条件下测出未知蛋白质的迁移率即可从标准曲线上求得近似分子量。率即可从标准曲线上求得近似分子量。 对有四级结构的蛋白质，该法测的是蛋白质亚基的分子量。对有四级结构的蛋白质，该法测的是蛋白质亚基的分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量 测定蛋白 标准蛋白R超离心法 其包括：沉降速度法和沉降平衡法其包括：沉降速度法和沉

13、降平衡法 沉降速度法沉降速度法： 在离心场中，蛋白质分子所受到的净离在离心场中，蛋白质分子所受到的净离心力（离心力减去浮力）与溶剂的摩擦心力（离心力减去浮力）与溶剂的摩擦阻力平衡时，单位离心场的沉降速度为阻力平衡时，单位离心场的沉降速度为定值，称为沉降系数或沉降常数。定值，称为沉降系数或沉降常数。 S=dx/dt/S=dx/dt/2 2 x x 蛋白质的沉降系数介于蛋白质的沉降系数介于1 11010-13-13到到200200 10 10-13-13秒的范围，秒的范围，1 1 10 10-13-13秒为一个秒为一个S, S,因此沉降系数因此沉降系数8 8 10 10-13-13表示为表示为8S

14、.8S. 蛋白质的沉降系数与分子量没有正比关系，因还受蛋白质分子摩擦系数（即蛋白质的沉降系数与分子量没有正比关系，因还受蛋白质分子摩擦系数（即分子形状）的影响。当同时测得扩散系数，则可利用斯维得贝格公式计算分分子形状）的影响。当同时测得扩散系数，则可利用斯维得贝格公式计算分子量。子量。 M=RTs/D(1-VM=RTs/D(1-V ) )D D 为扩散系数为扩散系数V V为偏微比容，蛋白质为为偏微比容，蛋白质为0.740.74厘米厘米3 3/ /克克 为溶剂的密度。为溶剂的密度。 该法还可用于鉴定蛋白质的均一性。该法还可用于鉴定蛋白质的均一性。超速离心机6000080000转/分重力60万80

15、万倍蔗糖密度梯度蔗糖浓度蛋白质的沉淀作用蛋白质沉淀的概念：蛋白质分子蛋白质沉淀的概念：蛋白质分子聚集而从溶液中析出的现象。聚集而从溶液中析出的现象。蛋白质的沉淀作用n等电点沉淀法等电点沉淀法n中性盐析沉淀反应中性盐析沉淀反应n有机溶剂沉淀反应有机溶剂沉淀反应n加热沉淀反应加热沉淀反应n重金属盐沉淀反应重金属盐沉淀反应n生物碱试剂沉淀反应生物碱试剂沉淀反应1.中性盐析沉淀反应 盐析作用：高盐时，因破坏蛋白质的水化层并盐析作用：高盐时，因破坏蛋白质的水化层并中和其电荷，促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，中和其电荷，促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，这种现象称盐析作用。这种现象称盐析作用。 机理：破坏蛋白质

16、的水化层并中和其电荷，因而促使蛋白质颗粒相互凝聚机理：破坏蛋白质的水化层并中和其电荷，因而促使蛋白质颗粒相互凝聚而沉淀。而沉淀。 盐溶作用：低浓度的盐可以使蛋白质溶解度增盐溶作用：低浓度的盐可以使蛋白质溶解度增加，称为盐溶作用。加，称为盐溶作用。 原因：低盐可以使蛋白质表面吸附某种离子，导致同性电荷增加而排斥增原因：低盐可以使蛋白质表面吸附某种离子，导致同性电荷增加而排斥增加，同时与水分子的作用也增强。加，同时与水分子的作用也增强。 盐析作用是由于当盐浓盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分度较高时，盐离子与水分子作用，降低蛋白质极性子作用，降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，基团与水分

17、子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水破坏蛋白质分子表面的水化层。化层。盐析沉淀的蛋白质盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有仍保持天然构象，即仍有活性。活性。盐溶作用是由于在盐浓度较低盐溶作用是由于在盐浓度较低时，盐离子被蛋白质分子吸附，时，盐离子被蛋白质分子吸附，带电表层使蛋白质分子彼此排带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而斥，而蛋白质分子与水分子间蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强了，的相互作用却加强了，因而溶因而溶解度增加。解度增加。 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其性基团的种类、数目以及排布的不同，其水水化层厚度

18、化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：不同的蛋白质分别沉淀。如：血清球蛋白清蛋白(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出 分分 段段 盐盐 析析 2.有机溶剂沉淀反应在蛋白质溶液中，加入一定量的与水在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。层，使蛋白质的溶解度降低而

19、沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高性，有机溶剂浓度不能太高(30%-(30%-50%)50%)，而且需要在低温条件下进行。，而且需要在低温条件下进行。3.加热沉淀反应加热可以使蛋白质变性，常常可导加热可以使蛋白质变性，常常可导致蛋白质的沉淀，一般在等电点时致蛋白质的沉淀，一般在等电点时最易沉淀。最易沉淀。应用：分离蛋白质时除去杂蛋白。应用：分离蛋白质时除去杂蛋白。4.重金属盐沉淀反应 蛋白质在蛋白质在pHpH大于等电点时带负电荷，可以与重金属离子结合，形成不溶性蛋

20、白质沉大于等电点时带负电荷，可以与重金属离子结合，形成不溶性蛋白质沉淀。淀。 应用：抢救重金属中毒的患者应用：抢救重金属中毒的患者5.生物碱试剂沉淀反应生物碱试剂是一些酸，如苦味酸等生物碱试剂是一些酸，如苦味酸等蛋白质在蛋白质在pHpH小于其等电点时带正电荷，小于其等电点时带正电荷，可以与生物碱试剂结合，形成不溶性蛋可以与生物碱试剂结合，形成不溶性蛋白质沉淀。白质沉淀。应用：血液样品分析中无蛋白滤液的制应用：血液样品分析中无蛋白滤液的制备备变性和沉淀的关系两者既有联系，又有区别：两者既有联系，又有区别： 变性蛋白质通常都是沉淀，但也有的不沉变性蛋白质通常都是沉淀，但也有的不沉淀。淀。 沉淀的蛋

21、白质：有的变性，有的不变性。沉淀的蛋白质：有的变性，有的不变性。蛋白质的分离纯化一、分离纯化的一般原则二、分离纯化的方法三、蛋白质分子量的测定研究其结构与功能研究其结构与功能工农业生产的需要工农业生产的需要医疗业的需要医疗业的需要研究需要研究需要一、分离纯化的一般原则:增加制品纯度或比活 电泳电泳 前前处处理理粗粗分分离离细细分分离离生物组织生物组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速离心解、差速离心选择性沉淀法选择性沉淀法亲和亲和层析层析离子交离子交换层析换层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶过滤过滤疏水疏水层析层析吸附吸附层析层析 (1)破碎： 目的：把蛋白质从原来的细

22、胞和组织中以溶解目的：把蛋白质从原来的细胞和组织中以溶解状态释放出来，并保持活性。状态释放出来，并保持活性。 动物组织和细胞：用电动捣碎机或匀浆器动物组织和细胞：用电动捣碎机或匀浆器 植物组织和细胞：研磨或纤维素酶处理植物组织和细胞：研磨或纤维素酶处理 细菌：超声波震荡、与沙研磨、高压挤压或溶菌酶处理细菌：超声波震荡、与沙研磨、高压挤压或溶菌酶处理 如蛋白质在细胞的某个组分：差速离心，如细胞核如蛋白质在细胞的某个组分：差速离心，如细胞核 前处理：提取 (2)(2)抽提：目的是使蛋白质溶解抽提：目的是使蛋白质溶解 根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提

23、水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提， 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提， 脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 (3)(3)分离：目的是除去其它蛋白质等物，缩小体分离：目的是除去其它蛋白质等物，缩小体积。积。 离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。 (4)(4)纯化：目的是使蛋白质进一步纯化纯化：目的是使蛋白质进一步纯化 可用层析法、电泳法等进行精制。可用层析法、电泳法等进行精制。 (5)(5)成品加工：真空冷冻干燥成成

24、品。成品加工：真空冷冻干燥成成品。大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50 20-50 mmol/Lmmol/L的磷酸盐缓冲液（的磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5pH7.0-7.5）或）或0.1 mol/L Tris-HCl0.1 mol/L Tris-HCl（pH7.5-pH7.5-8.08.0）缓冲液作提取液。）缓冲液作提取液。 电泳电泳 前前处处理理粗粗分分离离细细分分离离生物组织生物

25、组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速离心解、差速离心选择性沉淀法选择性沉淀法亲和亲和层析层析离子交离子交换层析换层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶过滤过滤疏水疏水层析层析吸附吸附层析层析(NH4)2SO4分级沉淀法（盐析）分级沉淀法（盐析） 等电点选择性沉淀法等电点选择性沉淀法 有机溶剂分级沉淀法（有机溶剂冷却、搅拌）有机溶剂分级沉淀法（有机溶剂冷却、搅拌） 使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。能浓缩蛋白

26、质，但分辨率低。 电泳电泳 前前处处理理粗粗分分离离细细分分离离生物组织生物组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速离心解、差速离心选择性沉淀法选择性沉淀法亲和亲和层析层析离子交离子交换层析换层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶过滤过滤疏水疏水层析层析吸附吸附层析层析一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率柱层析及电泳方法。n另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。结构分析之用。根据蛋白质根据蛋白质溶解度溶解度不同的分离方法不

27、同的分离方法 1 1、蛋白质的盐析、蛋白质的盐析 2 2、等电点沉淀法、等电点沉淀法 3 3、低温有机溶剂沉淀法、低温有机溶剂沉淀法 二、分离纯化的一般方法二、分离纯化的一般方法根据蛋白质根据蛋白质分子大小分子大小的差别的分离方法的差别的分离方法 1 1、透析：透析：利用蛋白质分子不能透过半透 膜，使蛋白质和其他小分子分开。 超滤：超滤：蛋白质的浓缩2 、凝胶过滤：凝胶过滤：利用蛋白质分子大小不同将蛋白分开。3 3、密度梯度离心：密度梯度离心：每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时停止，从而在离心管中分离成独立的条带透析袋透析袋酶溶液酶溶液蒸馏水蒸馏水加压加压酶溶液酶溶液超滤膜超滤

28、膜支持栅板支持栅板超滤液超滤液图图3-1 透析装置透析装置图图3-2 超滤装置超滤装置v凝胶作为支持剂v凝胶颗粒内部具有多孔网状结构。v被分离的混合物流过层析柱时: 凝胶过滤柱层析 （分子筛层析）大分子先下来大分子先下来小分子后下来小分子后下来分子筛层析原理示意图分子筛层析与洗脱曲线凝胶颗粒收集蛋白质管蛋白质混合物大分子从柱上面加缓冲溶液小分子洗脱体积（Ve）凝胶柱大分子小分子Ve1Ve2V0蛋白质Mr=49,000洗出液中的蛋白质浓度洗脱体积（mL）未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)G-200G-100logMrKav 凝

29、胶的种类和性质 交联葡聚糖凝胶（Sephadex) Sephadex G 系列 G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。 G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。 琼脂糖凝胶（Sepharose；Bio-Gel) 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越 大，网状结构越密集。 聚丙烯酰胺 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双 丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品 名为生物胶P （Bio-Gel P)。 聚丙乙烯凝胶（Styrogel) 大网孔结构。根据蛋白质根据蛋白质带电性质带电性质进行分离进行分离1 1、电泳法、电泳法 2 2、离子交换层析法、离子交换层析法 SDS-

30、PAGE separates proteins by MWSDSSDS（十二烷基硫酸钠）: :一种阴离子去污剂，作为变性剂破坏分子内的疏水作用和氢键。目前测定亚基分子量的最好办法。SDSboiling均勻带上一层负电荷所有的SDS-蛋白质复合体有相同的荷质比亚基构象改变，SDS-蛋白质复合体为棒状由于不同的由于不同的SDS-蛋白质复合体具蛋白质复合体具有相同的荷质比和相同的构象，因此有相同的荷质比和相同的构象，因此迁移率不受原有的电荷、分子形状的迁移率不受原有的电荷、分子形状的影响，只取决于分子量。影响，只取决于分子量。原态蛋白质 肽链伸展肽链伸展SDS 以其烃链与蛋白质分子的侧链结以其烃链与

31、蛋白质分子的侧链结合，每克蛋白可结合合，每克蛋白可结合1.4克克SDS，相当，相当于每两个氨基酸残基结合一个于每两个氨基酸残基结合一个SDS棒状离子交换层析离子交换层析ion exchange chromatography 离子交换层析分离蛋白质示意图低盐洗脱液低盐洗脱液高盐洗脱液高盐洗脱液混合蛋白质混合蛋白质常用的阳离子交换剂离子交换剂 可电离基团 可电离基团结构CM-纤维素（弱酸型） 羧甲基P-纤维素（中强弱酸型） 磷酸基SE-纤维素（强弱酸型） 磺乙基SP-纤维素（强弱酸型） 磺丙基常用的阴离子交换剂AE-纤维素（弱减型） 氨基乙基离子交换剂 可电离基团 可电离基团结构PAB-纤维素（弱

32、减型） 对氨基苯甲酸DEAE-纤维素 二乙基氨基乙基DEAE -Sephadex 二乙基氨基乙基DEAE -纤维素（强减型） 二乙基氨基乙基QAE-纤维素（强减型）二乙基（2-羟丙基） -氨基乙基（中弱减型）（中弱减型）等电聚焦（isoelectric focusing）原理: 在 一 定 抗 对 流 介 质 （ 如 凝 胶 ） 中 加 入 两 性 电 解 质 载 体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的pH区域，从而

33、使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用： 高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量pH10pH3pI1= pH8pI2= pH7pI3= pH5-+线性梯度双向电泳双向电泳利用配体的特异性亲和力的纯化方法 亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力，建亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。立起来的一种有效的纯化方法。 亲和层析经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离亲和层析经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。亲和层析最先用于酶的纯化

34、并从中得到发展，但现在已广出来，并且纯度相当高。亲和层析最先用于酶的纯化并从中得到发展，但现在已广泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器甚至完整的细胞的纯化。泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器甚至完整的细胞的纯化。亲和层析（affiuity chromatography）应用 分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能+待纯化分子配体a. 理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性+基质b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子原理：基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 s

35、epharose、sephadex亲和层析原理示意图蛋白质混合物配体与配体结合的蛋白质加入的可溶性配基专一性结合蛋白质没有结合的蛋白质非专一性结合蛋白质蛋白质浓度洗脱体积与配体专一性结合蛋白质加入配基基质 各各种亲和性载体及其及其专一性一性基团：免疫吸附剂，大多自行合成 单株抗体纯化对 a-D-葡萄糖、甘露糖基有专一性 Heparin Sepharose CL-6B Blue Sepharose CL-6B 5AMP-, 2, 5ADP-Sepharose 4B 用来纯化凝集素 酶的专一性结合Oligo (dT)-cellulose 配配 体体 親和性分子親和性分子 说说 明明(还有更多其它亲

36、和配体和载体) Oligo (dT)抗体 底物或抑制剂Protein ACon A刀豆素HeparinCibacron-BlueAMP, ADP单糖及衍生物对应的酶对应的抗原Lectin NAD(P)+ 结合酶NAD(P)+ 结合酶mRNA部分 IgG糖蛋白凝血蛋白等Pharmacia 金属螯合螯合层析法：法：Ni固相载体His HisHisProteinMetal Chelate Affinity Chromatographyimidazoleelution-O-C-C-C-O-C-C-C-NOHC-COOHC-COOHOH分离纯化蛋白质所依据的蛋白质性质分离纯化蛋白质所依据的蛋白质性质n大

37、小：大小：电泳、离心、凝胶过滤、超滤、透析电泳、离心、凝胶过滤、超滤、透析n形状：形状：电泳、凝胶过滤电泳、凝胶过滤n电荷：电荷：电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析n等电点：等电点：等电聚焦电泳、等电点沉淀等电聚焦电泳、等电点沉淀n疏水性（疏水补丁）：疏水性（疏水补丁）：疏水相互作用层析、疏水相互作用层析、反相色谱反相色谱n溶解度：溶解度：盐析、等电点沉淀、变性沉淀、有机溶剂盐析、等电点沉淀、变性沉淀、有机溶剂n密度：密度： （多数蛋白密度为（多数蛋白密度为1.3-1.4g/cm1.3-1.4g/cm3 3）密度梯度离心）密度梯度离心n配体结合能力：配体结合能力：亲和层析亲和层析n金属结合能

38、力：金属结合能力：金属螯合层析（酶的纯化）金属螯合层析（酶的纯化）n可逆性缔合：可逆性缔合：微管蛋白的纯化（温度依赖）微管蛋白的纯化（温度依赖）n翻译后修饰：翻译后修饰：凝集素亲和层析分离受体蛋白凝集素亲和层析分离受体蛋白n寻常性质：寻常性质：碱性磷酸酯酶、碱性磷酸酯酶、CaMCaM的分离纯化（耐热）的分离纯化（耐热）n基因工程构建的纯化标记：基因工程构建的纯化标记：His-NiHis-Ni的结合的结合ProcedureTotal protein（mg）Specific activity （mol mg-1prot min-1）Total activity（mol min-1）Recovery

39、（%）Purification（fold）Homogenate16030.009141001.020%-35% of （NH4）2SO4 fractionation700.1148.05712.7DEAE chromatography240.3047.35233.8FPLC100.515.13656.7超声破碎仪超滤装置UV monitorRecorderFraction CollectorColumnBufferReservoir柱层析实验装置自动部份收集器FPLC蛋白质的定量法浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3CuSO4与肽链的氨基结合280纳米处的紫外吸收 (1 OD280 = 1 mg/ml) 考马斯亮兰 ( Coomassie brilliant blue G250)与肽链结合后吸收谱变化 双金鸡宁酸双金鸡宁酸可蛋白质的纯度鉴定 蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法：电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。 OD280/ OD2601.75由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。胶体溶液。胶体溶液的性质，如丁达尔现象、布郎运动、胶体溶液的性质，如丁达尔现象、布郎运动、电泳现象、不能通过半透膜等。电泳现象、不能通过半透膜等。蛋白质胶体稳定的因素：具有水化层，非等电