土壤中分解尿素的细菌的分离和计数上课用PPT学习教案

1、会计学1土壤中分解尿素的细菌的分离和计数上土壤中分解尿素的细菌的分离和计数上课用课用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直不能直接接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成分解成氨氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶脲酶+第1页/共37页 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。菌也能分解尿素。从土壤中分离出能够分解尿素的细

2、菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌第2页/共37页启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。 问：问：如果请你寻找这种耐高温的酶，你会去如果请你寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找？哪里寻找？ DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应（PCRPCR）是一种在体是一种在体外将外将少量少量DNADNA大量复制大量复制的技术，此项技术要求的技术，此项技术要求使用使用耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶（93930 0C C）。

3、第3页/共37页问：问：为什么为什么TaqTaq细菌能从热泉中被筛选出来？细菌能从热泉中被筛选出来？ 水生耐热细菌水生耐热细菌TaqTaq：美国科学家布鲁克于美国科学家布鲁克于19661966年在美国黄石国家公园的一个热泉中发现，并分年在美国黄石国家公园的一个热泉中发现，并分离出耐高温的离出耐高温的TaqDNATaqDNA聚合酶。聚合酶。第4页/共37页 原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，高温高温淘汰淘汰了绝大多数微生物（了绝大多数微生物（不耐热不耐热），只有），只有TaqTaq细菌细菌被筛选出来。被筛选出来。（一）筛选菌株（一）筛选菌株原理原理：人为提供有人为

4、提供有利于目的菌株利于目的菌株生长的生长的条件（包括营养、温度、条件（包括营养、温度、PHPH等）等），同时，同时抑制或阻止抑制或阻止其他微生物生其他微生物生长。长。有选择作用第5页/共37页要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基基方法：方法： 抑制大多数微生物生长抑制大多数微生物生长 造成有利于该菌生长的环境，造成有利于该菌生长的环境，结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。释

5、涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。第6页/共37页从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属属于哪类培养基？于哪类培养基？固体培养基固体培养基葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 尿素尿素选择培养基选择培养基第7页/共37页 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能只有能合成脲酶合成脲酶的微的微生物才能利用尿素作为氮源而生存生物才能利用尿素作为氮源而生存。 缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。此培养基就

6、能够选择出分解尿素的微生物。第8页/共37页组别组别培养基类型培养基类型是否涂是否涂布接种布接种目目 的的实验组实验组以尿素为唯一氮源以尿素为唯一氮源的选择性培养基的选择性培养基是是对照组对照组牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培养基培养基是是分离尿素细分离尿素细菌菌用以判断选择性培养用以判断选择性培养基是否具有选择性基是否具有选择性对设计实验的训练对设计实验的训练第9页/共37页 对照组对照组牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 实验组实验组以尿素为氮源的培养基以尿素为氮源的培养基第10页/共37页常用方法：常用方法：稀释涂布平板法稀释涂布平板法、显微镜、显微镜直接计数法，直接计数法， 还可以用过滤膜

7、法还可以用过滤膜法：当样品的稀释度足够高时，：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。有多少活菌。 1 1个菌落个菌落 = 1 = 1个活菌个活菌 第11页/共37页 （2 2）操作方法：稀释涂布平板）操作方法：稀释涂布平板 统计菌落统计菌落数。数。（3 3）统计原则）统计原则 、选、选 30300 30300 个菌落的平板统计。个菌落的平板统计。 、每个稀释度取、每个稀释度取3 3个平板取其平均

8、值。个平板取其平均值。（4 4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此统计结果一般用数目低，因此统计结果一般用菌落数菌落数来表示。来表示。第12页/共37页同学同学平板平板1 1平板平板2 2平板平板3 3平均数平均数评价评价甲甲230230230230乙乙2121212212256256163163结论结论启示启示没有设置重复组，因此结果没有设置重复组，因此结果不具说服力。不具说服力。1 1个平板的计数结果与另个平板的计数结果与另2 2个个相差太远，说明在操作过相差太远，说明在操作过程程中可能出现了错误。中可能出现了错误。不能简单地将不能简

9、单地将3 3个平板的计数值用来求平均值。个平板的计数值用来求平均值。在设计实验时，一定要涂布至少在设计实验时，一定要涂布至少3 3个平板，作为重复组，才能个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。，需要重新实验。统计菌落数目统计菌落数目 P22第13页/共37页第14页/共37页 在做本课题的实验时，在做本课题的实验时，A A 同学从对应同学从对应10106 6倍稀释的培养基中筛

10、倍稀释的培养基中筛选出大约选出大约150150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出大约大约5050个菌落。个菌落。 其他同学认为其他同学认为A A同学的结果有问题。他们分析可能是同学的结果有问题。他们分析可能是A A同学的培同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。 但是，但是，A A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之

11、所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A A同同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出令人信学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出令人信服的证据。服的证据。 你能通过设置对照，帮助你能通过设置对照，帮助A A同学学排除上述两个可能影响实验同学学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？结果的因素吗？ 第15页/共37页是排除实验组中非测试是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。设置对照的方法：设置对照的方法： 空白对照：不给对照组任何处理因

12、素。空白对照：不给对照组任何处理因素。 条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的 处理因素。处理因素。 自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。 相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。A A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。种。一是由于土样不同一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误二是由于培养基污染或操作失误。第16页/共37页小结：通过这个事例可以看出，实验结

13、果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。是否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误无误；如果结果不同，则证明；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培同学存在操作失误或培养基的配制有问题。养基的配制有问题。第17页

14、/共37页 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。第18页/共37页应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土

15、壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的平板数的平板第19页/共37页微生物的种类微生物的种类土壤稀释倍数土壤稀释倍数目标目标分离土壤中所有细菌分离土壤中所有细菌10104 4、10105 5、10106 6平板上的菌落数应平板上的菌落数应为为3030300300个，便于个，便于准确计数。准确计数。分离土壤中的放线菌分离土壤中的放线菌10103 3、10104 4、10105 5分离土壤中的真菌分离土壤中的真菌10102 2、10103 3、10104 4分离土壤中的尿素细菌分离土壤中的尿素细菌1

16、0104 4、10105 5、10106 6、10107 7（二）土壤稀释（二）土壤稀释二、实验设计二、实验设计第20页/共37页10101 110102 210103 310104 410105 510106 610107 710g土壤土壤9ml无菌水无菌水 9ml 无菌水无菌水1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml10104 410104 410104 410105 510105 510105 510106 610106 610106 610107 710107 710107 7稀释涂布平板法稀释涂布平板法第21页/共37页如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个

17、以上菌落数目在3030030300的平的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，表明试验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。第22页/共37页第23页/共37页第24页/共37页1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。

18、2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030030300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。第25页/共37页第26页/共37页第27页/共37页 在以尿素为唯一氮源的培养基中加在以尿素为唯一氮源的培养基中加入入酚红酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细菌能升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。够分解尿素。第28页/共37页第2

19、9页/共37页第30页/共37页六、例题解析六、例题解析 例例1 1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是对细菌群体生长规律测定的正确的表述是 A A在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B B至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C C接种一个细菌接种一个细菌 DD及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体解析：细菌群体生长规律的测定生长规律的测定是人们在一定条件下进行是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长。在这些条件

20、下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。保证一定的接种量。答案：答案：A A第31页/共37页例例2 2在微生物群体生长规律的测定中，种内在微生物群体生长规律的测定中

21、，种内斗争最显著最激烈的时期是斗争最显著最激烈的时期是A A调整期调整期 B B对数期对数期 C C稳定期稳定期 D D衰亡期衰亡期解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来

22、越激烈，种内斗争就越来越激烈对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在。由此可知，在稳定期稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，数目已经开始减少，pHpH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。环境的斗争。答案：答案：C C第32页/共37页1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ） A.A.在液体培养基上进行

23、在液体培养基上进行 B.B.至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（ ） A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ( ) ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素A AC CD D第33页/共37页4.4.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（ ） A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品