密度梯度离心基础

1、密度梯度离心基础余兴明 中科院上海生物化学研究所概论转头选择密度梯度选用一、 概论 在密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。梯度液的密度随着离心本经的增大而增加。密度梯度可以予形成，也可以在离心过程中自形成，经常，密度梯度的可以分为：速率一区带（Rate-30nal）离和等密度（Isopycnic）离心。 在速率一区带离心中混合样品的以很薄的一层铺在梯度液的上部，在离心过程中由于不同组份"颗粒"在梯度液中沉降速率的差别，而在离心的某一时刻形成了数个含左第一级份颗粒的"区带"。离心过程在最垂"的样品（

2、或者说沉降得最快的样品）形成沉殿前就停止了。样品在离心后与梯度液一起收集，用常规技术去除梯度材料后就得了某个较纯的成份。每个单一组份的沉降速率取决于它们的形状、尺寸、密度、离心力的大小、梯度液的密度和粘性系数。 对于相类似的生物体组份常常形状也相似。在速率区带离心中我们常常使梯度液的最大密度不超过样品在该梯度中浮密度。利用这类生物组份在尺寸上的差异的形成的沉降速率的不同，选择某一特定时刻，当它们中的各个纯样品区带之间的距离拉得最远时停止离心即可以达到分离目的。 与速率一区带离心法不同的是，等密度离心是依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的。混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚

3、至和梯度液混在一起。最后一种方法依靠离心力来形成梯度（自形成梯度）在形成梯度的过程中由于样品各单一成份向它们自己的等密度区靠扰即达到了分离纯化的目的。对于速率一区带离心，梯度液最大密度一般小于样品中各组份的密度，也就是说是在样品正在沉降过程中的不是在形成沉殿后来分离样品；而等密度离心法中，梯度液的初始最大密度常常超过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。密度梯度离心法的理论依据是（参考文献1）每种纯样品成份在梯度液中的沉降速度可以表达为：V=d2÷18×(-s)÷×2r式中V是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒）

4、d：样品颗粒的直径（厘米），我们在初步计算时就假说样品颗粒为球体。非球形颗粒样品，可以以上式为基础进行修正。：样品颗粒的密度（克/厘米3）s：密度梯度液的密度（克/厘米3）：密度梯度液的粘性系数（克/厘米·秒）：离心机重轴的旋转角速度（1/秒），=2N÷60，N：转/分r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）当>S时 V>0即样品顺离心力方向沉降 S时 V 0即样品逆离心力方向上浮=S时 V=0即样品停止沉降或上浮，"稳定"在这一位置用这个公式可以很好地解释在速率一区带离心法或等密度离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。二、

5、转头的选择：1、 离心转头分类：转头类别使用的离心机发明时间、发明者或推广商固定角式转头低、高、超速1943年，（英）Pickels甩平转头低、高、超速1951年，（德）Kahler垂直管转头高、超速1974-1975年，（美）Dupont公司区带转头低、高、超速1964-1965年，（英）Anderson、（英）MSE公司近垂直管转头超速1989年，（日）Hitachi Koki、（美）Beckman公司连续离心转头低、高、超速1965年，（英）MSE公司其他特种转头：分析转头，土壤脱水转头，细胞浮选转头，管式转头，血球比测定转头，细胞清洗转头等等。2、 各种转头用于密度梯度离心的比较：（I

6、） 各种转头用于速率一区带（R-z）离心的优缺点分析： 固定角式转头：壁部放应影响很大，用于R-z离心回、收率低，纯度也受影响一般知用于差分离心和等密度离心，离心时间向较短。是各其离心机的最高速转头。 甩平转头：细长离心管用于R-z离心可以获得较高纯度和高分辨率，且容易控制离心时间，壁部入在很少。25000rpm30000rpm的甩平转头最适用于亚细胞器的离心分离，而4000042000rpm的甩平转头适合用于核酸、蛋白、病毒草类物质内流的分离。离心时间较长。 垂直管转头：沉降距离最短，因而离心分离时间也是短。最大半径前几乎没有壁部放位，最大本径后右一定壁部效位，垂直剖面积较大，因而离心后纯样

7、品区带的容量也较大。但在有沉殿的密度梯度离心中，沉淀和浮动区带方向转换之间存在干扰，可能影响纯样品区带的纯度。大部份R-z离心没有沉殿，垂直管转头很适合做R-z离心。 近垂直管转头：管轴线与旋转主轴之间倾角7度9度（角式转头20度45度）沉降距离比垂直转头稍大，离心时间比角式，甩平转头都要短。由于右了倾角，沉殿可沿管壁滑向低部，因此基本上清除了沉殿与浮动区带转换之间的干扰，适合做R-z离心，特别适合做生物大分子（如质粒DNA）的自形成梯度等密度离心。 区带转头：没有壁部入应特别适合做大容量的病毒，亚细胞器，生物大分子的R-z离心，可用于研究，中试和少批量生产。分离纯度高，量大，但操作要求高，转

8、头及整体价格昂贵。 连续流离心转头：工作原理的区带转头相似，可连续工作，分离量大，分离统纯度高，可用于各种生物体的差分，R-z等密度离心。近年来高速连续流转头常用于大量发酵液（大肠样菌、酝母菌）菌体的沉殿。（II） 各种转头用于等密度离心内优缺点分析： 固定角式转头：主要用于差分离心的角式转头，在速离心机上可以很好地用于等密度离心，尤其是DNA平衡等密度离心，自形成梯度，用快速密封管或厚壁管，常用的单管的容量为1015ml,常用转速4000060000rpm，离心时间较短，分离纯度也较高。 甩平转头：用作等密度离心时，壁部效应对分离效果影响较少，梯度变换在甩平时自然过渡因而很适合做等密度离心实

9、验，优点是回收率高，分辨能力强。缺点是沉降距离长，最高转速较低（由于结构层固此类转头最主转速一般在60000rpm以下）因而，离心时间很长，对某些长离心管，1015ml容量的转头最高转速在4000041000rpm，用作自形成CSCL梯度的质粒DNA离心往往需要5070小时。 垂直管转头：适合作等密度离心，沉降距离最短，在没有沉殿或沉殿非常坚实的情况下，对于现代可自由选择加速、减速时间的离心机，梯度转换得很好。这类转头转进很高（目前最高转速可达100000rpm，70000xg）离心时间最短，分离纯度高，样品容量较大（垂直剖面积最大）。 近垂直转头：九十年代以后开始使用的新型转头，用作生物大分

10、子（DNA，RNA，蛋白质等）的平衡等密度离心最佳，目前这类转头的最高转速已达90000rpm近650000xg），离心时间相比垂直转头稍长。 区带转头：非常适合做大容量样品的等密度离心 连续流离心转头：高、低速连续流转头一般不用作密度梯度离心超速连续流转头适合做大容量样品的等密度离心分离。（三）密度梯度-材料和梯度型式的选用1、 对于速率-区带密度梯度离心，梯心度选择要点（I） 概述：用速率一区带法下简移尺R-z法进行分离的主要原理是依靠不同样品在梯度中沉降速率的不同来分离（比化样品，因此希望样品在沉降能通过整个离心管长度的提高分辨率。作为最基本条件就是梯度液的最大密度必须少于样品颗粒的密度

11、。用有密度梯度的支持液作R-z离心有以下优点：*当样品中不同组份分层进入梯度液时，梯度的较高密度支持着样品这样就使样品各个不同密度的层次以较窄（或较薄）的区带沉降从而得到期较高的分辨率（或较高的纯度）* 梯度液的密度一般是从离心管上部到底部逐渐增加，这样就可以稳定液栓，提示抗对和抗机械扰动的能力（接近离心过程结束时，纯样品区带和它的支持液的密度差较少）* 梯度液粘性系数逐渐增大也使纯样品区带变窄从而提示了分辨率而逐渐减缓的沉降速度使同一组份样品逐渐靠扰，提高了分离纯度。（II） 梯度、材料的选用 一个理想的梯液就具备：化学稳定性好；高溶合度；低渗透性；在溶剂中稳定性；较低的光吸收特性；价廉等。

12、遗憾的是很难找到一种适合于各种R-z离心的完美无缺的梯度液。 对于大参数R-z离心，蔗糖是比较合适的梯度材料。尽管它在高密度（>30% W/N）时粘性每数较大，但综合比较表明它可以广泛应用。但由于蔗糖在各种密度时（即使是低密度时也如此）右较高的渗透性，分离一些对渗透性敏感的生物体组份时需要选择其他梯度材料，如由pharmacia公司开发的Ficoll等等。在大多数情况下，梯度液的PH值应与被分离时生物样品的生理PH值一致。对密度梯度材料的基本要求：a） 能够配制所需要的密度范围b） 粘性系数较低c） 溶合度高d） 有密度与光折射率的对照资料e） 对被分离样品无损害f） 对被分离样品渗透很

13、少g） 在离分离完成后很容易与生物样品分离h） 化学了性放稳定i） 对离心过程中所接触的转头材料，离心管，管盖及密材料，连续流及区带转头的管道等等无腐蚀作用j） 纯度高k） 毒性少l） 价格较低m） 已知该材料的某些物理、化学、热力学性能。常用的梯度材料有：蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、酒石酸钾、溴化钠、溴化钾、碘化钠、碘化钾、氯化铯、氯化铷、硫酸铷、三氯（耳苯酸钩、三氟醋酸铯、右旋糖苷，白蛋白、Ficoll, percoll, mettizamide, Nycodebnz, Ludox, Dextian等等（III） 梯度形状的选择： 所谓梯度形状是指梯度介质没着离尽管长充方向的密度变化特征。

14、用于R-z离心密度梯度常用连续梯度也变是密度随着离心本径的增加而光滑地（不是实变化）增大，直线型的，光滑曲线型的（一般用凸指数或凹指数曲线，或凸凹指数曲线联用的）都属于连续梯度。不连续（阶梯型）梯度采用于等密度离心。*线型：在甩平转头中做R-z离心最常用线性梯度。制各线性梯度时要注意：（a） 在甩平或垂直转头中制各线性梯度时，梯度液西的密度必须足支持样品，而底部密度必须少于被分离样品组份的密度。（b） 一般地说较大的梯度斜率可以得到较高分辨率（c） 蔗糖的常用线性梯度范围是520%W/V或1040%W/V（d） 可以用梯度议制各线性梯度，也可以人工辅设整个价梯型梯度，离心管二静置一致时间后也可

15、以形成近线性梯度。*等运动梯度（等速梯度）（Isokinetic） 等运动梯度是指在某一恒定离心转速时，样品颗粒在梯度中以定常速度沉降。在做到等速沉降，必须使梯度和粘性力的增加与沿着离心本径方向的离心力增加相平衡，在这种梯度液中，颗粒的沉降距离与离心时间，离必力，以及颗粒本身的沉降多数成正比。因此如果已知某单一组份样品的沉降分数，就可以算出在同一梯度中沉降的其他组份的沉降系数。 在甩平转头中用等速沉降梯度时，从旋转中心算起的离心距离与沉降系数的关系应该是线性关系。 为了构造等速沉降梯度种慢必须注意到转头、离心管，梯度合质的密度，浓度和粘性系数在同一温度。 在甩平转头中作蛋白质分离常用520%（

16、W/V）的蔗糖梯度在5摄氏度离心可以达到近似的等速沉降的效果，而1030%（W/V）的甘油梯度在5摄氏度时分离DNA或RNA也可以达到近似等速沉降的目的其他大金数样品分离的等速沉降梯度是凸指数型曲线。*凸型指数曲线与凹型指数曲线梯度： 为了支持样品使其中组份在离心开始前不致于沉入梯度，我们常常望梯度曲线在近度面处有较陡的斜率，也就是说在近液面处梯度液的密度沿离心管长度方向增加得很快。这就是凸指数曲线梯度，与比相反，如果液面处梯度液足以支持（托住）样品，故虑到某些样品在离心管中下部需要较慢的沉降率（在高密度区）才能得到理想的分辨率，那么凹型指数曲线型梯度变能满足这个要求。*复合型梯度： 如果用程

17、序梯度仪来制备梯度，那么上节中的凸凹指数曲线梯度可以复合在同一梯度液中，这样的复合梯度在它们各自的区域保持了它们各自的优点。当然也制备其他类型的复合梯度。一般说，复合梯度多用于区带离心。（2）等密度离心，梯度要素的选择：（I） 梯度材料及梯度溶液选择： 所有的等密度离心都使用水溶性缓冲剂作溶剂，缓冲剂的组成及PH值取决于生物样品的性质。对细胞，亚细胞结构或其他生物大分子的等密度离心分离各有不同要求。常用于等密度离心梯度材料有：材料名称DNARNA核蛋白膜亚细胞器细胞病毒蔗糖不适合不适合可用较好较好可用较好Ficoll不适合不适合不适合可用可用最佳较好CSCL最佳较好最佳不适合不适合不适合较好P

18、ercoll不适合不适合不适合可用较好较好可用Nycodez可用可用最佳最佳最佳较好较好从上表可以看出，对R-z离心蔗糖是很好的梯度材料，而对于等密度离心，不同的生物样品对梯度材料的要求有较大差异。（II） 梯度型式选择： 离心时，溶液中各种组份都同时处在离心声中，被分离的组份及梯度材料的分子都在离心力作用下向离心管底部（甩平、角式）或外壁（垂直管、近垂直管、区带转头、连续流转头）沉降。对于梯度材料，如果它们的沉降速度在离心初始阶段远大于浓度扩散速度，那么就可以形成连续的密度梯度。这就是"自形成梯度"产生的基本原理。我们可以把被分离样品和梯度材料混合在一起离心，梯度材料去离

19、心过程中形成密度梯度，而样品中不同组份则沉降（或上浮）到它们自己的等密度区。 另一种方法是预先制备好密度梯度，将样品铺在离心管（或区带转头）的某一部份（如离心管上部，下部或中部），离心，使样品中各种组份沉降（或上浮）到它们自己的等密度区前后，从而达到了我们所需要的"平衡"结果。 预先形成梯度可以是不连续的（阶梯型），也可以是连续梯度。阶梯型不连续梯度大多适用于从植物或动物组织的匀浆中分离整细胞或亚细胞器，或用于某些病毒的纯化。而连续梯度由于共密度平滑地变化，对于某些生物样品的多种成份组合的分离可以得到较低市制分辨率而得到了广泛的应用。 选择自形成梯度还是预形成梯度，主要取决

20、于材料的性质。如果些胶体硅材料可在1000020000xg的离心声中离心30分钟就可以自形成梯度（例如美国Du pont公司的的Ludox及瑞典pharmarcia公司的Percoll）。但对某一些材料，自形成梯度的时间很长，对离心力的要求也很高。如CSCL或Meterizamide需要去50000500000xg的离心声中离心数少时甚至数十小时才能自形成梯度（如用CSCL做质粒DNA分离，梯度液中加E.B.和Triton x-100，在490000xg需要离心4小时，才能利用CSCL的自形成梯度分离出质粒DNA，染色体DNA，RNA和蛋白质。） 预形成梯度的主要优点是离心时间较短，因为我们只

21、要故虑样品中某个组份到达其等官度区所需要的时间。预形成梯度常被用来分离较大颗粒，如>100S的样品。预形成梯度的缺点是*被分离样品的容量较少（与自形成梯度相比）*对某些样品如细胞或病毒会因单向沉降而产生颗粒聚结从而减少了样品回收率至影响纯度。*预先制备样度液需较长时间，亦较繁复。 与预形成梯度相比较，自形成梯度有较大样品容积（特别是使用垂直剖面积较大的垂直管或近垂直离心这个优点更突出）；可以简单地高速初始密度；离心过程中样品既右上浮又右沉降，也就是混在梯度液中的样品在离心过程中，在梯度材料自形成梯度的同量从离心力的正反二个方向向自己的等密度区靠扰，最后排列在自己的等密度区上下形成纯样品区

22、带。从这个意义上说，样品是真正到达了自己的等密度区而具有很高制纯度。自形成梯度的等密度离心又称均衡等密度离心（Eguilibrim-Isopycnic）（III） 自形成梯度 综上所述，某些梯度材料能够在离心过程中形成密度梯度，Ludox,Percoll中的胶体硅颗粒可以较快地向离心管靠低（如甩平转头）等或外侧（垂直管转头）而另一些材料如CSCL，CS2SO4，Metrizamide等则在沉降过程中爱到共反向浓度扩散的影响，达到平衡的时间就比较长。平衡后梯度曲线的形状不仅依赖于梯度材料本身，也取决于其他一些离心条件。自形成梯度的最基本条件是样品中需要分离的各种组份在分离后都就包含在梯度范围中。

23、最佳的自形梯度形状还应该使被分离后都处在各自的较窄的纯样品区带内，只有这样才能得到较高的分辨率。但很多单一组份在尺寸和密度上都有差异。就使得同种样品区带离心后显得比较宽。为了提高分辨率变必须使梯度曲线变得陡一些，但要随心所欲做到这一点都很困难。 幸运的是对于所有梯度材料，计算自形成梯度的公（也就是自形成梯度曲线的形成原理）是一样的。由于用CSCL分离质粒DNA已有近30年历史，大多数定量分析工作集中于讨论CSCL梯度。 用下面的一些公式可以计算自形成梯度曲线的形状，可用于设计最合适的密度梯度。*梯度曲线的斜率：密度梯度曲线中某一点的最终斜率ds/dr可以用下式计算：是角度（弧度/秒） ：从旋转

24、中心到计算点的距离（cm）o：梯度材料的密度梯度比例常数o的数值请参考余兴明"质粒DNA的超速离心分离"或J.B.Martin"Biopolymers"9，1970，P597用这个公式计算梯度曲线的中下部占3/4离心管中梯度高度的ds/dr值比较接近实际情况，对上部1/4长度与实际情况有些差别。从上面公式可以看出，要质曲线变陡a：降低ob：提高转速c：加大离心半径d：增大初始密度 以同等转速离心，甩平转头的r较大，在同等初始密度条件下，甩平转头的密度梯度曲线比垂直管转头，近垂直转头或固定角式转头都要陡一些。（参见下图）CSCL初始密度为1.72g/cm3

25、时的自形成梯度曲线 九十年代以前生物大分子离心分离实验多数是利用甩平转头，转速在60000rpm以下，某些实验一次要离心数十小时，使用的CSCL也较多（分析纯，价格高，且不能反覆使用）离心分离成本昂贵（如80年代初期，质粒DNA分离，CSCL初始密度为1.71g/cm3，33000rpm，20摄氏度甩平转头离心72小时，一次离心就用去了驱动部1.4亿转的的寿命，而当时的超速离心机驱动部的保用寿命才100亿转，虽然由于CSCL去离心后梯度曲线较陡而获得了很纯的质粒DNA和染色体DNA，但成本实在是太高了）。九十年初开始使用近垂直管（或秒少角度管）转头，在CSCL梯度中加入E.B.和Triton

26、x-100，初始密度1.55g/cm378000rpm，20摄氏度离心4小时（用去驱动部寿命0.187转）或用垂直锭，同样的梯度100000rpm，20摄氏度2小时（用去驱动部寿命0.12亿转）都获得了满意的结果。（文献5）*梯度的密度范围：在不同距离处（r2,r1）密度差可以用下面公式表示：从上式可以看出（S2-S1）值不得和转速的平方而且和距离的平方差成正比。*转头选择对梯度曲线斜面率与梯度范围时影响：从前面的曲线图可以看出对不同转头，梯度曲线的差异： 甩平转头离心时和复原（离心完成）后对于梯度来说，离心管中液面至管底距离保持不变。对固定角式，小角度转头及垂直管转头，离心头沉降距离很微短，

27、而在离心后复原时这项距离明显拉长了，也就是说梯度曲线变得平缓了，这种距离的延伸右利于离心分辨率的提示。因此垂直管转头比NVT（近垂直管）转头，NVT转头比角式转头的距离延伸更大，分辨率也就更高。但与此相反，纯样品带的宽度都是甩平转头最窄，垂直管转头最宽。*梯度中的最大和最少少密度： 计算前，首先要找到等密度点的位置等密度点：离心层密度与率心开始时初始密度相等的点。对于甩平转头：设等密度点少rc式中 rt：梯度表面与旋转中心距离：rb：离心管底与旋转中心距离 该公式可用于估算离心结束时（转头刚开始减速时）角式转头及垂直管转头的rc位置。 设梯度液初始密度（均匀）为Si，在求得rc后梯度中最大密度

28、与最少密度可用下式计算：如果已经设计好密度变化范围就可以计算所需要的离心转速：* 计算实例DNA分离，CSCL梯度，初始密度1.70g/cm3，根据离心要求，理想的最大密度为Sb=1.75 g/cm3最少密度为St=1.65 g/cm3用某甩平转头最高转速55000rpm，rb=12cm，rt=6.7cm则N=45500rpm，校核：由于密度>1.2 g/cm3按规定这个转头的最高转速不能超过：=46200rpm46200rpm>45500rpm所以，以上设计成立。* 离心时间计算：计算例题中离心所需要的时间：已知r平均=9.35cm，样品S20，w=15* 讨论 必须注意不能使C

29、SCL在离心管底部最大密度超过1.90 g/cm3120oC）否则CSCL将可能析出结晶，而CSCL的结晶密度为4 g/cm3，很可能在结晶的局部损坏塑料离心管，从而造成CSCL泄漏而进一步腐蚀转头，（特别是铝合金转头）而造成转头在离心中炸裂的严重事故。为安全起见，生金属的梯度实验不要去铝合金转头或甩平转头中的铝合金吊桶中做。（IV） 预形成梯度：* 不连续（阶梯形）梯度： 分层铺设不连续梯度，样品铺在梯度液之上，离心时不同组份越过少于本身浮密度时梯度层次而最后达密度样品浮密度的梯度界面之前形成纯样品区带。一般设置三至五个层次。* 连续梯度 根据被分离样品的性质设计线性，凸指数，凹指数或凹凸复合指度曲线梯度。样品一般铺在梯度液上部离心分离，要注意的是某些梯度材料（如重金属器）预形成梯度在离心过程中由于离心力和浓度扩散的复合作