酶联免疫技术

1、1会计学酶联免疫技术酶联免疫技术1.ELISA的原理的原理2.ELISA的类型的类型3.试剂准备试剂准备：免疫吸附剂免疫吸附剂 结合物结合物 酶底物的准备酶底物的准备 4.对照设定对照设定5.标本的采取和保存标本的采取和保存6.结果判断结果判断 ELISA ELISA是一种免疫测定（是一种免疫测定（immunoassayimmunoassay，IAIA）。基础）。基础: :抗原或抗体的固抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为相化及抗原或抗体的酶标记，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或有色产物，

2、产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。定量分析。-利用抗原抗体的特异性反应作为识别手段，用酶催化底利用抗原抗体的特异性反应作为识别手段，用酶催化底 物等方法作为显示系统，用微孔板等材料作为载体和分物等方法作为显示系统，用微孔板等材料作为载体和分 离系统的一种生物学检测方法。离系统的一种生物学检测方法。-结合物与相应的抗原（抗体）反应后，结合的酶仍能催结合物与相应的抗原（抗体）反应后，结合的酶仍能催 化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量待测物的含化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量待测物的含 量。量。1.ELISA的原理的原理酶免疫测定类型酶免疫测定类型 这种固相酶免

3、疫测定方法在这种固相酶免疫测定方法在19711971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent AssayEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称），简称ELISAELISA。酶免疫技术酶免疫技术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均相酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定1.11.1抗原抗体反应抗原抗体反应 可逆性可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应抗原与抗体结合形成

4、抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：式为：Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗体的亲和力（抗体的亲和力（affinityaffinity），可以用平衡常数），可以用平衡常数K K表示：表示：K=AgK=AgAbAbAgAb ,AgAgAb ,AgAbAb的解离程度与的解离程度与K K值有关。值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。特异性特异性 抗原抗体的结合

5、发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。最适比例最适比例 敏感性敏感性化学比色法的敏感度为化学比色法的敏感度为mg/mlmg/ml水平水平酶反应测定法的敏感度约为酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达标记的免疫敏感度可提高

6、数千倍，达ng/mlng/ml水平水平例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可达，其敏感度可达0.1ng/ml0.1ng/ml。1.41.4免疫测定在临床检验中的应用免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。此免疫测定的应用范围极广。固相载体抗体酶抗原酶标记抗原方法一方法一: :直接竞争法直接竞争法( (包抗体包抗体) )1.1.将抗体

7、包被在固相载体上将抗体包被在固相载体上。2.2.加入样品和酶标记抗原加入样品和酶标记抗原, , 两者竞争板上的抗体两者竞争板上的抗体. .3.3.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。样本/标品(抗原)方法方法: :反应步骤少反应步骤少, ,操作简单操作简单; ;特异性不如间接竞争法特异性不如间接竞争法. .酶抗抗体酶标记抗抗体抗体偶联抗原样本/标品固相载体方法二方法二: :间接竞争法间接竞争法( (包被抗原包被抗原) )1.1.将抗原包被在固相载体上。将抗原包被在固相载体上。 2.2.加入样本和抗体后，若样本中加入样本和抗体后，若样本中 含有抗原，则将和板上抗原竞争含有抗原，则将和板上抗原竞争

8、结结合加入的抗体。合加入的抗体。3.3.再加入酶标记抗抗体，则结合再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原为抗原- -抗体抗体- -酶标记抗抗体复合物酶标记抗抗体复合物。4.4.酶催化底物并显色酶催化底物并显色方法二方法二:二步反应二步反应,操作比较简单操作比较简单,有有放大灵敏度和增强准确度的放大灵敏度和增强准确度的作用作用酶抗原酶标记 抗体样本/标品(抗原)抗抗体固相载体抗体方法三方法三: :间接竞争法间接竞争法( (包二抗包二抗) )1.1.将抗抗体（二抗）包在固相载体将抗抗体（二抗）包在固相载体上。上。2.2.加入抗体，则结合为抗抗体加入抗体，则结合为抗抗体- -抗体抗体复合物。复合物。3.

9、3. 加入样本和标准品及酶标记抗原加入样本和标准品及酶标记抗原，两者竞争结合抗体。，两者竞争结合抗体。4.4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。方法三方法三: :二步反应二步反应, ,操作比较简单操作比较简单, ,在加样本时容易出现时间在加样本时容易出现时间差而影响检测结果的准确差而影响检测结果的准确度度. .酶抗抗体酶标记抗抗体抗体样本/标品（抗原）固相载体方法四方法四( (一步法反应一步法反应) )1.1.将抗原（或二抗）包被在固相载体上。将抗原（或二抗）包被在固相载体上。 2.2.加入样本和酶标记二抗或酶标抗原加入样本和酶标记二抗或酶标抗原后，最后加入抗体，三种一起混合后，最后加入抗体

10、，三种一起混合反应。形成抗原（二抗）反应。形成抗原（二抗）-抗体抗体- -酶标记抗抗体（抗原）复合物。酶标记抗抗体（抗原）复合物。4.4.酶催化底物并显色酶催化底物并显色 “一步法反应一步法反应”方法四方法四: :操作简单操作简单, ,方便方便, ,快速快速. .反应灵敏反应灵敏. .抗抗体取有取有机溶剂时，应注意避免交叉污染）机溶剂时，应注意避免交叉污染）用的用的底物，使发生酶促反应而显色底物，使发生酶促反应而显色 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2为供氧体，为供氧体， H2O2为受氢体。为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。一般为无色化合物，

11、经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺如：邻苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS 。双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体包被固相载体和制备和制备酶结酶结合物合物而建立此法。而建立此法。双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释用特异性抗原进行

12、包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAgHBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。构的不同，寻找合适的标记方法。间接法测抗体间接法测抗体 传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗同一酶标抗抗体体建立检测相应抗体的方法。建立检测相应抗体的方法。竞争法测抗体竞争法测抗体 当抗原材料

13、中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。此法检测特异性抗体。 竞争法测抗原竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点位点，因此不能用，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小

14、分子激素、药物等合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISAELISA测定多用此法。测定多用此法。捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体IgMIgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgMIgM抗体包被固相，以捕获血清抗体包被固相，以捕获血清标本中的标本中的IgMIgM（其中包括针对抗原的特异性（其中包括针对抗原的特异性IgMIgM抗体和非特异性的抗体和非特异性的IgMIgM）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。此法常用于病毒性感染的早期诊断。酶免疫测定类型酶免疫测定类型 这种固相酶免疫测定方法在这种固相酶免疫测定方法在19711971年最初建

15、立时称为酶联免疫吸附剂测定（年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent AssayEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称），简称ELISAELISA。酶免疫技术酶免疫技术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均相酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定1.11.1抗原抗体反应抗原抗体反应 可逆性可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：式为：Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗体的亲和力（抗体的亲和力（affinityaffinity），可以用平衡常数）