第十四章 基因重组与基因工程

1、基因重组与基因工程基因重组与基因工程Genetic Recombination & Genetic Engineering 考核要求考核要求 1.掌握基因重组的原理掌握基因重组的原理 2.熟记基因工程技术中的基本原理熟记基因工程技术中的基本原理 3.叙述基因工程的过程叙述基因工程的过程 4.熟悉分子探针的运用熟悉分子探针的运用l基因重组基因重组 (gene recombination) 是指是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。制和表达的功能。 l基因工程

2、基因工程 (genetic engineering） 是指采用人工方法将不同来源的是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，进行重组，并将重组后的并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。表达的过程。 基本概念第一节：DNA的重组重组类型：重组类型： 同源重组同源重组 细菌介导的基因转移与重组细菌介导的基因转移与重组 特异位点的重组特异位点的重组 转座重组转座重组一、同源重组一、同源重组 同源重组同源重组是指在两个是指在两个DNADNA分子同源序列间分子同源序列间通过链的断裂和再连接，进行单链或双通过链的断裂和再连接，进行单链或双链片段的交换，又称为基本重

3、组，是最链片段的交换，又称为基本重组，是最基本的基本的DNADNA重组方式重组方式. .在真核生物和原核在真核生物和原核生物都有发生。生物都有发生。片段重组体片段重组体(patch recombinant)(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) (splice recombinant) 内切酶内切酶 (recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶(recBCD) DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5

4、 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 3 3 3 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)5 3 5 5 5 3 3 3 拼接重组体拼接重组体5 5 5 5 3 3 3 3 5 3 5 5 5 3 3 3 DNA连接酶连接酶意义意义 1. 在减数分裂过程中，同源染色体之间在减数分裂过程中，同源染色体之间 进行交换，形成生物个（群）体的多样性。进行交换，形成生物个

5、（群）体的多样性。2. 是是DNA损伤修复的重要机制之一。损伤修复的重要机制之一。二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组一、接合作用一、接合作用(conjugation)(conjugation)二、转化二、转化(transformation) (transformation) 三、转导三、转导 (transduction)(transduction)四、细胞融合四、细胞融合 以上均是在不同以上均是在不同DNADNA分子间发生的共价连接。分子间发生的共价连接。二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接当细胞与细胞、或

6、细菌通过菌毛相互接触时，质粒触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的至另一细胞（细菌）的DNA转移称为转移称为接合接合作用作用(conjugation)。可接合质粒如可接合质粒如 F F 因子因子(F factor) (F factor) （二）转化作用（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细菌或培养的受体细胞获得新的遗传表型，使细菌或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为称为转化作用转化作用 (transformation)。 例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。（三

7、）转导作用（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间时，发生在供体细胞与受体细胞之间的的DNA转移及基因重组即为转移及基因重组即为转导作用转导作用(transduction)。噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)*转染(transfection)l 转染是转化的一种特殊形式。转染是转化的一种特殊形式。 由由transformation（转化）和（转化）和 i

8、nfection（感染）两词构成。（感染）两词构成。l 原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。导入受体细胞的过程。l 通过感染方式将外来通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。l 将任何类型将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫转移至动物细胞内的过程均可叫转染。转染。三、位点特异重组三、位点特异重组位点特异重组位点特异重组(site-specific recom-bination) 是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个D

9、NA序列的特异位点间发生的整合。序列的特异位点间发生的整合。（一）（一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒合反转录病毒cDNA的长末端重复序列的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 P1H1P2hinH2阻遏基因DNAHin重组酶P1H1P2hinH2阻遏基因沙门氏菌沙门氏菌HH片段倒位决定鞭毛相转变。片段倒位决定鞭毛相转变。 H片段片段H1鞭毛蛋白鞭毛蛋白H2鞭

10、毛蛋白鞭毛蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白P2P2hixhix（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链，由两条轻链(L链链)和两条和两条重链重链(H链链)组成，分别由三个独立的基因族编组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链码，其中两个编码轻链( 和和 )，一个编码重链。，一个编码重链。 轻链的基因片段：轻链的基因片段：重链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 重链重链(IgH)基因的基因的V-D-J重排和轻链重排和轻链(IgL)基因基因的的V-J重排均发生在特异位点上。

11、在重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，片段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组片段的两侧均存在保守的重组信号序列信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基因。此重排的重组酶基因rag (recombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质共有两个，分别产生蛋白质RAG1和和RAG2。 CACAGTG (12/23) ACAAAAACCGTGTCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段V片段片段J片段片段RSSRSS间插间插DNAOHOHVJ单链切开单

12、链切开RAG1RAG2分子内转酯反应分子内转酯反应单链切开单链切开转移核苷酸转移核苷酸修复、连接修复、连接免疫球蛋白基因重排过程免疫球蛋白基因重排过程l 免疫球蛋白重链基因由一组可变区基因（免疫球蛋白重链基因由一组可变区基因（VH）和一组恒定区基因（和一组恒定区基因（CH）构成，通过这些基因）构成，通过这些基因的选择性转座和重组，就可以转录表达出各种的选择性转座和重组，就可以转录表达出各种各样的免疫球蛋白重链，以对付不同的抗原。各样的免疫球蛋白重链，以对付不同的抗原。 四、转座重组四、转座重组由插入序列和转座子介导的基因移由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座位或重排称为转座(tran

13、sposition)。插入序列插入序列(insertion sequences, IS)组成：组成：二个反向重复序列二个反向重复序列(inverted repeats, IR)侧翼的正向重复序列侧翼的正向重复序列 一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因 IRTransposase GeneIR转座形式：转座形式：保守性转座保守性转座(conservative transposition)复制性转座复制性转座(duplicative transposition)（一）插入序列转座（一）插入序列转座插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座转座子转座子(transposon

14、s) 可从一个染色体可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。位点转移到另一位点的分散重复序列。 转座子组成：转座子组成：反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposase Gene抗性基抗性基因因（二）转座子转座（二）转座子转座由转座子介导的转座由转座子介导的转座第二节第二节重组重组DNADNA技术技术重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一

15、个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术技术制造医学上重要的药物。制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰技术生产胰岛素的工厂岛素的工厂1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉英国罗林研究所成功的克隆了多莉一、相关概念一、相关概念DNA克隆克隆工具酶工具酶目的基因目的基因基因载体基因载体二、基本原理及操作步骤二、基本原理及操作步骤 本节主要内容本节主要内容克隆克

16、隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即即无性繁殖。无性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆DNA克隆克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的接合成一具有自我复制能力的DNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而通过转化或，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一胞，再进行扩增提取获得大

17、量同一DNA分子，也分子，也称称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。酶工程、细胞工程等。目的目的 分离获得某一目的基因或分离获得某一目的基因或DNA 获得目的基因的表达产物（蛋白质）获得目的基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) 实现实现基因克隆所用的方法及相关的工作，又称基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组重组DNA技术。技术。（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆

18、转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补

19、3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷

20、酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)识别识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其并在识别位点或其周围切割双链周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。的一类核酸内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H作用：作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源修饰系统，限制外源DNA， 保护自身保护自身DNA。分类：分类：、类类（基因工程技术中常用的是基因工程技术中常用的是类类）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大

21、写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序HHaemophilusaemophilus ininfluenzae fluenzae d d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点：类酶识别序列特点： 回文结构回文结构(palindrome)切口：切口：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCA

22、GCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为后，产生相同的粘性末端，称为同尾同尾酶酶 。 这 两 个 相 同 的 粘 性 末 端 称 为。 这 两 个 相 同 的 粘 性 末 端 称 为 配 伍 未 端配 伍 未 端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A（三）目的基因（三）目的基因 cDNA (complementary DNA) 基因组基因组DNA (g

23、enomic DNA)（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特序列被扩增而特意设计的载体称为意设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为成多肽链而特意设计的载体称为表达

24、载体表达载体。载体的选择标准载体的选择标准 能自主复制；能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。1. 质粒质粒 (plasmid)特点特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 细菌染色体外细菌染色体外的小型环

25、状双链的小型环状双链DNADNA分子。分子。噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2. 噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列 Multiple Cloning Sites3. 柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)pJB8的物理图谱的物理图谱酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体腺病毒

26、载体腺病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体杆状病毒载体杆状病毒载体其他其他二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理目的基因的获取目的基因的获取重组重组DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1. 化学合成法化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列基酸序列 。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA

27、library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 1.化学合成法化学合成法由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNADNA基因片段基因片段克隆载体克隆载体重组重组DNADNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌存在于转化细菌内存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合2. 基因组基因组DNA文库文库限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化

28、限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制3.3.cDNAcDNA文库文库 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T

29、 AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T是一种在体外利用酶促反应大量获是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组得特异序列的基因组DNA或或cDNA的专的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。门技术，又称为无细胞的分子克隆。4. 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接粘性末端连接方式方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接（二）克隆载体的选择和构建二）克隆载体的选择和构建Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4

30、DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点的连接不同限制酶切位点的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAE

31、co R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。2. 平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切

32、酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连3. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外

33、切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体4. 人工接头人工接头(linker)连接连接由平端加上带有新的酶切位点的接头，由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。端连接。Eco REco REco R人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态

34、(competent) 导入方式导入方式转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹 2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等( (插入失活法插入失活法) )抗药性标记选择抗药性标记选择组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大

35、肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成DNA重组体重组体标志补救标志补救 互互补补的的检检测测原原位位杂杂交交Southern印迹印迹鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出重组重组DNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNADNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基

36、因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达1. 原核表达体系原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）标准：标准：选择标志选择标志强启动子强启动子 翻译调控序

37、列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达真核蛋白质不能加工表达真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：操作技术难、费时、费钱操作技术难、费时、费钱转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2. 真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、哺乳类动物细胞酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱