聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction

1、聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction上海第二医科大学 检验系 樊绮诗PCR技术技术由美国Cetus公司K.Mullis 于1983年建立能在体外复制已知序列的DNA片段具有扩增效率高和特异性强的特点为生命科学领域的研究开创了崭新时代PCR原理原理5533d.NTPs耐热DNA聚合酶引物5353535353535353添加反应混合液添加反应混合液及样本及样本变性变性535353535353退火退火加入试管中加入试管中延伸延伸53535353继续延伸继续延伸535355TaqTaq353TaqTaq55循环循环PCR原理原理5353535355335353

2、第二个循环第二个循环4个拷贝个拷贝第三个循环第三个循环8个拷贝个拷贝53535353535353535353533553535353第第n个循环个循环2n个拷贝个拷贝PCR原理原理PCR的反应体系参与PCR反应的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）变性温度和时间 模板DNA充分变性是PCR顺利进行的前 提。在PCR扩增开始的第一次变性时， 应给 予足够的时间和温度，使基因组DNA充分变 性。一般在940C变性510 min。进入循环反 应后以94变性3040s,

3、足以使模板DNA双 链变性。 退火温度和时间 PCR反应的特异性取决于退火时引物 模板的特异结合。退火温度一般低于引物 Tm50C左右，退火温度越高，产物的特异 性也越高；被扩增片段越大，退火所需时 间也相应延长。 延伸温度与时间 延伸温度设为72， 因为Taq DNA聚合酶在72时具较高的酶促活性，有利于DNA的复制。延伸时间视产物长度而异，时间过长易导致非特异性扩增。模 板 (template) 模板就是将要被复制的核酸片段（包括基 因组DNA和RNA、质粒DNA和线粒体DNA 等）模板DNA须有较高的纯度模板加入量影响PCR效率和产物的特异性引 物（Primers) 化学合成的寡核苷酸能

4、与模板特异地结合引物决定产物的特异性和长度引物设计时必须遵循一些原则 引物设计基本原则PCR反应的引物需要二条，分别设在被 扩增目的片段的二端，并分别与模板正 负链序列互补引物的长度一般以1825个核苷酸为宜二条引物之间（尤其在3端）的序列不 可有互补，以免形成引物二聚体 引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、 嘧啶碱基堆积 引物设计基本原则引物的3端尤其要避免重复的CG碱基序列 二条引物的Tm值不能差别太大 Tm=2（A+T）+4（C+G） 合成引物时在其5端可以加修饰成份设计引物最好用电脑软件进行分析 脱氧核苷三磷酸（dNTP） 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧 核苷三磷酸的

5、混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异 性扩增也随之增加 DNA聚合酶从一种生活在热泉（8090）中的水栖 噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取， 有很高的耐热稳定性 Taq 酶的作用: 催化DNA合成。即在模板指导下，以dNTP 为原料，在引物3-OH末端加上脱氧单核苷 酸，形成3, 5 -磷酸二酯键，使DNA链沿 53方向延伸 镁离子浓度镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应 系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性十分重要虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关， 但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及 鳌

6、合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离 Mg2+的浓度从而影响酶的活性。配制PCR反应体系（例）PCRPCR反应体系反应体系(25(25m ml l) ) 试剂浓度试剂浓度体积体积( (m ml)l)终浓度终浓度去离子水去离子水 15.815.8 正向引物正向引物10 10 m mmolmol/L/L1.0 1.0 0.40.4m mmolmol/L/L反向引物反向引物10 10 m mmolmol/L/L1.0 1.0 0.40.4m mmolmol/L/L1010PCRPCR反应缓冲液反应缓冲液10102.5 2.5 1 1镁离子镁离子25 25 mmolmmol/L/L2.5 2.5 2

7、.52.5mmolmmol/L/LdNTP dNTP 25 25 mmolmmol/L/L0.2 0.2 200200m mmolmol/L/LTaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶1 1U/U/m ml l1.0 1.0 0.040.04U/U/m ml l模板模板DNADNA100100ngng/ /m ml l1.0 1.0 4.04.0ngng/ /m ml l 其它反应因素 pH应保持在酶反应所需的最适pH盐浓度（引物与模板杂交率、杂交体稳定性 及聚合酶的活性）二甲亚砜（DMSO）能破坏模板的二级结构牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶 的活性循环次数 重复次数一般设为253

8、5个循环35个循环以后由于反应体系中各种反应组分的消耗和反应副产物的产生，此时扩增产物量不再随 循环次数的增加而呈指数增长，即反应已处于平 台期n指数增长期n线形增长期n平台期循环数 # 理论值 实际值Log 产物DNAPCR过程的实时监测 相对定量PCR设计相对定量PCR实验方案时须注意：预先确定最佳模板量和PCR循环数，使所 采用的各反应参数在扩增指数范围内，避 免平台效应。“管家基因”与靶基因同管扩增，扩增产物 的长度应有所不同，以保证电泳能将两者 分离开。 理论值实际值Log 产物DNA绝对定量绝对定量 PCR1.外参照系统的设置2.内参照系统的设置 实时定量 PCR 对核酸扩增反应进

9、行直接和动态的监测， 实现对靶基因的实时定量分析TaqManTM5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQ5353TaqManTMExtension Step531. Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53QTaqR354. Dete

10、ction533QTaqR5l lR53RQPCR产物的检测凝胶电泳分析： 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳酶切分析分子杂交 Southern印迹杂交、斑点杂交核酸序列分析DNA突变的PCR检测技术PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP） 等位基因特异性寡核苷酸 （allele specific oligonucleotide, ASO）单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP） 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 融点曲线分析（melting curve analysis）PCR产物的序列分析 PCR-SSCP单链DNA分

11、子具有特定的二级空间构象，取决于该分子本身的碱基组成。突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，从而能区别正常与突变的DNA 不同顺序 不同构象 不同电泳行为 SSCP技术检测技术检测DNA突变突变sSouthern印迹杂交印迹杂交 DGGE是一种筛选单碱基突变及多态性的方法。DGGE检测突变的原理是基于给定DNA双链的解链温度因存在突变而发生改变加以测定。DGGE的突变检出率可达90%100%。 变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳 (DGGE)DGGE检测检测DNA突变突变PCR产物的序列分析 主

12、要见于分子克隆时对于目的基因扩 增片段的序列鉴定以及对致病基因检测时 分析扩增片段中点突变的位置和性质。 可将产物纯化后作为模板直接测序， 也可将PCR产物克隆入载体后再测序，后 者测序的效果更好 ，常用T-A克隆。PCR反应的特点特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高 指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 简便、快速 24 小时完成扩增对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板 PCR技术的质量控制实验室的规范化设置： 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 PCR技术的质量保证： 基因扩增检验的全过程的质量保证

13、 室内质量控制和室间质量评价 PCR实验系统中的污染源及防污染措施 以PCR为基础的相关技术逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)定量PCR (quantitative PCR )多重PCR (multiplex PCR) 免疫PCR差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR)PCR诱导定点突变原位PCR (in situ PCR) 图例图例 差异显示差异显示RT-PCR(Differential display RT-PCR)RT-PCR(Differential display RT-PCR)PCR技术在

14、分子诊断中的应用感染性疾病中病原微生物核酸的检测单基因遗传性疾病的基因诊断多基因病相关基因的检测肿瘤相关基因的检测移植配型和法医学上的应用遗传性疾病的基因诊断遗传性疾病的基因诊断 （例：血红蛋白病中的地中海贫血） 1 2 3 41.正常内对照2.Barts水肿标本3.反应体系故障扩增失败4.分子量标准PCR用于-地贫Barts水肿产前诊断血友病的分子诊断X染色体连锁隐性遗传 F基因和F基因发生突变 血浆凝 血因子和的合成量和（或）质的异常 患者反复自发性出血SSCP、DGGE等检测技术 DMD的分子诊断X染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病，发病率 为1/3 500个男孩DMD基因位于Xp21.2-21.3，全长2500Kb DMD基因的突变导致dystrophin缺陷检测DMD基因的技术： Southern印迹、多重PCRPCR在移植配型上的应用 二十世纪80年代后期，分子生物学技术被引入HLA领域，人们在PCR基础上发展了各