实验三小规模制备质粒DNA国家农业科学数据中心农业

1、实验三 小规模制备质粒DNA(碱变性-SDS法、SET法)一、 目的学习几种小规模制备质粒DNA的技术，比较这几种方法所制备的几种质粒DNA的效果。二、 原理在本章第一节介绍的载体中，有PUC系列、PBS与PBR322均属拷贝数较高的质粒，只要用小规模制备一次的质粒DNA，就有足够的量用于常规的基因工程操作。小规模制备质粒DNA的特点是可以一次制备多种质粒DNA(1224个不同的质粒DNA样品)，速度快，时间省，步骤简化，DNA纯度好，可以用于酶切、连接，甚至多纯化几次还可做双链DNA序列分析的模板等常规基因工程操作之用。其中碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异

2、而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分 离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。只是将溶液和溶液试剂和加入的比例做了修改，这种修改增加了质粒DNA在溶液中的粘度，减少了KAc的离子强度。这种方法对分子量稍大的质粒DNA更合适。用各种不同孔径的凝胶住层析，进行分离纯化蛋白

3、质、酶、核酸等生物样品的技术。目前也常用DNA的微量过柱以达到纯化DNA的目的。DNA的微量过柱常用Sephadex G50葡聚糖凝胶，做成约300微升凝胶的Eppendorf管小柱，对15微克的DNA样品离心过滤20秒钟，就能得到很高的纯化效率。这种过柱的样品可以直接进行DNA测序分析。三、 材料(一)仪器 接种针 1ml移液管 1.5ml Eppendorf管 200ml吸头 冰块 牛皮纸 纱布盖 线绳(二)器皿微量移液器 涡流混合器 低温高速离心机1.5mlEppendorf管培养皿(三)菌种1. 大肠杆菌HB101 (pBR 322)2. 大肠杆菌JM103 (pUCl8)3. 大肠杆

4、菌TGI (pBS SK+)4. 大肠杆菌C600 pXZ6(四)培养基1LB液体培养基，100ml LB150ml三角瓶，加100微升100毫克毫升AP，分装于10m1的试管中，每支试管加2毫升(LB十AP)。2LB液体培养基20ml LB50ml三角瓶加20微升50毫克毫升Str。3氨苄青霉素(AP)，临用时用无菌水配制在无菌Eppendorf管中，浓度为100毫克毫升。可存于-20数周。4链霉素(Str)，临用时用无菌水配制在无菌Eppendorf管中，浓度为100毫克毫升。可存于-20数周。(五)试剂1溶菌溶液：20毫升 4mg/ml溶菌酶 50mmol/L葡萄糖 10mmol/L E

5、DTA 25mmol/L Tris-HCl (PH 8.0) 配置方法：临用前吸取母液 200mmol/L葡萄糖5毫升 250mmol/L EDTA 0.8毫升 1mmol/L Tris-HCl (PH 8.0) 0.5毫升 称取溶菌酶80毫克 加ddH2O至20毫升2SET溶液50毫升20%蔗糖50mmol/L EDTA50mmol/L Tris-HCl PH 7.6配制方法：吸取母液50mmol/L EDTA 5毫升1mol/L Tris-HCl (PH 7.6) 2.5毫升再称取10克蔗糖于烧杯内，加水30毫升，加热充分溶解，加重蒸水至50毫升。107.87kPa（11公斤平方厘米）灭菌

6、20分钟。3碱性SDS溶液80毫升0.2mol/L NaOH1% SDS配制方法：吸取母液10mol/L NaOH 1.6毫升20% SDS 4毫升加dd H2O至80毫升43molL NaAc (pH48)溶液40毫升。51.5molKAc (pH48) 50毫升：称取乙酸钾735克，加30毫升重蒸水，加热溶解，再用冰乙酸约5毫升调PH至4.8，加重蒸水定容至50毫升。6. 100mmol/L NaAc，50mmol/L Tris-HCL (pH8.0) 溶液30毫升配制方法：吸取母液3mol/L NaAc 1毫升1mol/L Tris-HCl (PH8.0) 1.5毫升加 ddH2O至30

7、毫升 7异丙醇(上海化学试剂一厂，分子量分析纯下同) 8无水乙醇 9TE缓冲液 10氮仿：异戊醇(24：1)溶液 11Tris-HCl (PH8.0) 溶液饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)临用时取TrisHCL饱和酚，加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，即可。 1270乙醇量取95乙醇70毫升，加重蒸水25毫升混匀，置4冰箱备用。l 310毫克毫升RNase A溶液(同实验一)145molL NaCl溶液(见附录61)l 513PEG溶液称取6.5克聚乙二醇6000(PEG)，加入40毫升，加热充分溶解，加重蒸水定容至50毫升。16Sephadex G50(Pharmacia公司)17W

8、izardTM微量DNA纯化试剂盒(Promega公司)(1)细胞悬浮溶液：50mmol/L Tris-Hcl, PH7.510mmol/L EDTA100mg/ml RNase A(2)细胞裂解液：0.2mol/L NaOH1% SDS(3)TE缓冲液:10 mmol/L Tris-HCL ，PH7.51 mmol/L EDTA(4)复性溶液：3 mol/L NaAc ，PH4.8(5)柱洗溶液：200 mmol/L NaCl20 mmol/L Tris-HCl ，PH7.55 mmol/L EDTA终浓度55%乙醇(6) WizardTM DNA纯化胶(7) WizardTM微量柱 四、

9、方法(一) 小规模碱变性SDS法制备质粒DNA1. 将大肠杆菌TGI (pBS)，JM103(pUCl8)HB10T(pBR322)，C600(PXZ6)，菌落各挑取一环分别接种在2毫升10毫升试管含有抗菌素的LB液体培养基中，37振荡培弄过夜，1618小时(每个菌株备接种3支)。2. 转移以上各株菌液1.5毫升于Eppendorf管中，以高速台式离心机在室温下14krmin离心15秒。3. 小心移去上清液，把Eppendorf管倒立在吸水纸上吸干，再把沉淀物在旋涡混合器上摇匀。4. 加入100微升溶菌溶液，把Eppendorf管子盖紧，倒翻4次，冰水浴放置10分钟。5. 加入200微升碱性S

10、DS溶液，温和地翻转Eppendorf管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)冰水浴5分钟。6. 再加入150微升3mol/L NaAc(pH48)溶液，将Eppendorf管盖紧后轻轻来回倒翻23次，混合均匀后于冰水浴20分钟。7. 高速台式离心机，14krmin，室温离心15分钟。8. 将上清液转移到另一个Eppendorf管中(不要把底部混浊物吸进去)。加入1毫升冷的无水乙醇(或加满为止)，盖紧，并翻倒Eppendorf管3次。9. 把Eppendorf管放在-20冰箱30分钟l小时，沉淀DNA或者放置在液氮罐的液氮介面上方5分钟沉淀DNA(千万不能把样品浸在液氮内)，也可以放在干冰加酒

11、精中(-70)15分钟。10. 取出样品，在高速台式离心机中15krmin离心10分钟。11. 移去上清液(可以倒去)，加入室温100mmol/L NaAc，50mmol/L Tris(pH8.0)的溶液100微升，让DNA完全溶解(约10分钟)。12. 摇匀样品后再加入200微升冷的无水乙醇，放置在-70冰箱10分钟。13. 在高速台式离心机中15krmin离心10分钟，收集沉淀物。14. 用100微升100mmolL NaAc，50mmol/L TrisHCI (pH8.0)，溶解DNA。并加入4微升核糖核酸(1mgml的RNase A，临用前将l0mgm1的RNase A稀释10倍)37

12、C保温15分钟。15. 加入200微升预冷无水乙醇，放置在-70，5分钟沉淀DNA。16. 在高速台式离心机中15krmin离心10分钟，收集沉淀物。17. 加500微升70乙醇于Eppendorf管中，2分钟后倒去，弃去70的乙醇，然后将Eppendorf管倒吸在卫生纸上，尽量吸干乙醇，用parafilm包口，打洞，在真空中抽干。18. 每管沉淀物加40微升无菌重蒸水，用手轻弹数下溶解质粒DNA，或旋涡振荡器振荡，离心2秒钟，集中DNA(C600PXZ6几管合并于一管，仅加20微升ddH2O)。19. 取样5微升，在0.8的琼脂糖凝胶(加EB)中电泳，小电泳槽电压为40100v，3分钟到1小

13、时。20. 观察DNA区带，鉴定分离的DNA。 如果分离不纯可用下列步骤再度纯化，尤其是进行酶切之前，更为必要。 加200ulTE，再加入等体积的酚、氯仿和异戊醇(体积之比为25：24：1)，混合后，以8kr/min离心5分钟，吸取上清液至另一个Eppendorf管中。 把留在原Eppendorf管中的有机溶剂相，再加入等体积的TE缓冲液，以8krmin离心5分钟，取出上清液合并到上一个Eppendorf管中的上清液里(小心操作，不要把中间层的蛋白质污染进来)。 重复抽提一次：加入等体积(相当于步的二倍体积)的氯仿和异戊醇(24：1)，混匀后以8krmin离心5分钟，取上清液于另一个Eppen

14、dorf管中。 加入5mol/L Nacl至最终浓度为20mmol/L，然后加入2倍体积的无水乙醇，置-70冰箱10分钟或液氮罐表面5分钟沉淀DNA。 以15krmin离心15分钟，弃去上清液，再加70乙醇500微升洗涤沉淀物，弃去乙醇，再放真空箱抽干。 加入20微升TE缓冲液，用手反复掸几次，或旋锅振荡器振荡溶解，离心2秒钟以集中DNA，存于-20备用。(二) SET法1 将大肠杆菌TGI(pBs)，JM103(pUC18)，HB1o1(PBR322)，C600(pXZ6)菌种各挑取一环，分别接种在2毫升10毫升试含有抗菌素的LB液体培养基中(每个菌株各接种3支)，37振荡培养过夜816小时

15、。2 转移以上各株苗液于Eppendorf管中，以高速台式离心机在室温下14krmin离心15秒。3 倒弃上清液，把Eppendorf管倒立在吸水纸上吸干，然后在旋涡振荡器上振均匀。4 加1毫升SET溶液，悬浮各菌株，充分均匀，然后再14krmin离心15秒。5 重复3。6 加150微升SET溶液，5微升10molml RNase A，充分振荡均匀，翻转3次，于50水浴15分钟。7 加350微升碱性SDS溶液，温和翻转Eppendorf5次(溶液由混浊变透清)，冰浴5分钟。8 加150微升的1.5moIL KAc(pH48)，翻转Eppendorf管5次，冰浴20分钟。9 在台式离心机内14k

16、rmin离心10分钟，将上清液倒入另一干净Eppendorf管(注意不要把沉淀也倒入上清液中)。10 加入等体积的饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)盖紧盖子，于旋涡振荡器振荡3s秒钟，于8krmin离心5分钟。11 小心吸取上层水相于另一Eppendorf管内，加等体积氯仿：异戊醇，盖紧盖子于旋涡振荡器上振荡3秒于8krmin离心5分钟。12 重复11。13 上清液加0.6倍体积的异丙醇混匀，于室温沉淀1530分钟，14krmin离心10分钟。14 倒去上清，倒立Eppendorf管于吸水纸吸干。然后真空干燥抽干(用parafilm包好，用针头打洞)。15 用400微升重蒸水悬浮DNA，用

17、手反复弹数次，或于旋涡振荡器振荡离心3秒，集中DNA。16 加40微升3mol/L KAc加1毫升预冷无水乙醇，混均匀于一2030分钟。17 14krmin离心，10分钟，弃上清。18 用500ul 70乙醇洗二次，弃上清。19 重复14。20 加40微升无菌重蒸水悬浮DNA，电泳检测DNA浓度与纯度。这时抽提到的DNA可用于酶切连接，如果需要用做DNA序列分析模板，则要做如下处理。21 在40ul 重蒸水悬浮的DNA中，加入16微升的4mol/L NaCl，80ul的13PEG6000。混均匀，于冰浴20分钟以上。22 14000r/min离心10分钟，弃上清后，再离心3秒钟，用吸水纸小心伸

18、入Eppendorf管中(注意在沉淀DNA的相反方向)吸去余下的PEG。23 重复18。24 重复14，然后加20微升TE悬浮DNA，并取l微升电泳检测其大致浓度。(三) 微量过柱法纯化DNA1 Sephadex G50过柱法(1)(8)同本实验方法(一)l8(9)把pendorf管置于一20下1020分钟。(10)在高速台式离心机中15krmin离心10分钟。(11)倒弃上清液，真空抽干，用2040微升1ugml RNase A的TE充分悬浮，3710分钟。(12)将微型柱套入Eppendorf管内，取约150微升的Sephadex G50水合凝胶子微型柱内(见提示部分)，5kr/min离心

19、1分钟以弃水分，重复一次。(13)将微型柱套入一洁净Eppendorff管内，做好标记，将(11)的2040微升的DNA样品全移入柱内，10krmin离心20秒钟。(14)取下微型柱，Eppendorf管内的液体为纯化的DNA样品，取0.51微升样品进行琼脂糖凝胶电泳检测纯度。2 WizardTM小量DNA的纯化方法(1)加200微升细胞悬浮液，充分振荡均匀。(2)加200毫升的细胞的裂解液，温和翻转数次，因DNA变性，可见细胞悬液变清。(3)加200微升的复性溶液，温和翻转数次。(4)15kr/min离心15分钟。(5)将上清液移至一洁净Eppendorf管内。(6)将WizardTM凝胶摇

20、匀，取l毫升加入Eppendorf管样品内，混匀。(7)将一只23毫升的塑料注射器，拔出注射器内芯推液筒，插上WizardTM微型柱，然后在微型柱上套Eppendorf管。(8)将(6)内的胶全部移入注射器内，用注射器内芯推液筒，慢慢地将胶和DNA样品推入微型校内。(9)将注射器从微型柱上拔出后，拿去注射器内芯推液筒，再将注射器套在微型柱上，加入2毫升柱洗溶液，用注射器内芯推液筒慢慢将洗校液推入微型柱内，以洗涤凝胶样品。(10)拔去注射器，将微型柱套在Eppendorf管上，15krmin，离心2分钟，使凝胶甩干，(7) (10)的Eppendorf管内的液体均为废液。(11)将微型柱套在一洁

21、净的Eppendorf管内，在柱上加50微升的重蒸水或TE，约1分钟后DNA即溶于水中，15krmin离心30秒钟。(12)移去微型柱，将Eppendorf管内的DNA样品存于一20备用。五、 提示1. 实验安排：三个实验方法一天内就可制备36个以上DNA样品，只需要在实验的前一天下午接好苗，培养过夜。并作些器皿与试剂的准备工作，而溶菌溶液，碱性SDS溶液中各成分要在实验临用前将母液配制在一起。三个方法的菌液离心可一次进行，然后再分别按三个方法的步骤进行。为了避免搞错，在编号上要做好记号，在写号码时，最好养成一个习惯，如顺着Eppendorf柄的方向写，这样可以免去把9与6，12与21等顺序搞

22、错，特别是每次用酚，氯仿、乙醇等有机溶剂时，要注意盖紧，不要把写的号码搞乱了，做的样品多了，尤为要注意。2. 方法的改进：该法是快速制备少量的质粒DNA，它可供限制性内切酶酶切，凝胶电泳。Southern blot与DNA序列分析等使用，当实验提取pBR322质粒DNA在数量上要求不多时，也可以来用该法提取。在我们教材中，多处介绍提取质粒DNA的各种方法。便于大家因地制宜的采用。而本实验中的提取方法，在许多实验室都经常地采用它，因而积累了许多不同的经验，目前国内外一些实验室又将碱变性SDS法的实验进行简化，并用异丙醇代替乙醇，大大缩短了实验的时间，现将方法介绍如下： 单细胞菌落接种到2m1 L

23、B培养液(相应抗菌素)振荡培养34小时或过夜 将培养液装满在Eppendorf管中离心后弃上清液，加入100mmol/L Tris-HCl (PH 7.5)、5mmol/L EDTA缓冲液100ul充分悬浮加入200ul的0.2molL NaOH、1SDS溶液，冰浴10分钟加入150ul的3mol/L KAc (pH4.8) 溶液，冰浴10分钟15kr/min离心10分钟，吸出上清液，加入1m1异丙醇，于室温(-18)1530分钟 15kr/min离心10分钟，沉淀物用70乙醇洗涤三次，在真空干燥器中快速干燥DNA，然后溶解在40ul ddH2O中取出4ul DNA，加入1ul RNase(浓度为200 u