高级分子生物学

1、抗体芯片技术的应用黄雪梅 060907030 高级分子生物学摘要 :抗体芯片 , 是蛋白质芯片的一种 , 是检测生物样品中蛋白表达模式的新方法。 这种 新技术可以在一次实验中比较生物样品中成百上千的蛋白质的相对丰度 , 将极大促进蛋白质 组目前的研究状况。 抗体芯片可以分析样品之间的差异 ; 确定相应蛋白质的性质 ; 分析细胞提 取物或者血清蛋白质混合物 ; 还可以进行生物化学平行分析 ; 检测蛋白表达水平变化。 抗体芯 片虽然发展的时间比较短 , 但是进展迅速 , 在多个领域中得到了较好的运用。关键词:抗体芯片、应用、检测前言 :自从 DNA 芯片被研制出来之后, DNA 芯片技术已经逐渐被

2、应用于对生物样品中 的各种已知或未知的核酸序列表达的检测和比较研究。 但随着人类基因组的工作图谱的顺利 完成和后基因组时代的到来, 人们发现仅从基因组序列的角度无法完整、 系统地阐明生物体 的功能, 因此, 科学工作者的重心开始转向基因的表达产物蛋白质的研究上来, 蛋白 质组学成为人们的研究重点。本文主要对抗体芯片技术的应用作了一个简单的综述。 l. 抗体芯片产生的背景蛋白质组学是指一种生物、 一个基因组或一种细胞、 组织在特定时空上所拥有的全套蛋 白质。 细胞内的蛋白质通常都要经过基因转录后的加工和翻译后的加工。 经过转录后选择性 剪接、 RNA 编辑以及蛋白质翻译后的剪接、修饰等,使得蛋白

3、质的数量大大增加。 蛋白质芯 片 , 又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列,是指以蛋白质分子作为配基 , 将其有序地固定在固相 载体的表面形成微阵列;用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用,洗去未结合的成分, 经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度, 来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间 的相互作用关系。 蛋白质芯片可以分为蛋白质功能芯片和蛋白质检测芯片。 蛋白质功能芯片 是在一特定模板上固定成千上万个蛋白质分子 , 用于蛋白质功能的研究 ; 而蛋白质检测芯片 则含有蛋白质检测试剂 , 用于蛋白质的定性、定量测定。抗体芯片技术作为蛋白质芯片的一 种在此基础上也在不断的发展。 抗体芯片是蛋白质芯片的

4、一种, 是依赖于抗体作为亲合体固 定在固相载体的表面 , 通过特异性的免疫反应捕获待测样品中的抗原, 从而实现高通量的免 疫检测, 可以一次性的检测上百上千种蛋白质的表达丰度。 抗体芯片具有特异性强, 敏感性 高,检测范围广等优势,已经应用在医学、生物学、药学等多个领域,是蛋白质芯片研究中 进展速度较快的一个分支 1。2. 抗体芯片的分类1平板芯片:早期的蛋白芯片大都将蛋白质直接点样在硝酸纤维素膜或者玻片上 , 芯片 密度低。 微孔芯片:它能够检测携带报告基因或者荧光指示剂的单个细胞。 微孔芯片能够 将反应局限化 , 不仅减少样品的用量 , 而且可以减少邻近微孔之间液滴的相互流动。 微流路 芯

5、片:微流路芯片由通过管道连接微孔组成 , 允许在微型化的形式下处理液体 , 通过蛋白激酶 A 的变化来监测蛋白质的磷酸化水平。其他芯片: SELD I 芯片 , 表面质子共振 ( SPR 芯片 , 以及以磁珠为基础的芯片。3. 抗体芯片的稳定性及优缺点保护抗体不变性是抗体芯片一个重要参数 , 在点样或者后来与靶蛋白孵育的过程中的水 分蒸发可以导致抗体变性。抗体芯片的另外一个重要参数是保持芯片的长期稳定性 , 尤其是 保持高密度抗体芯片的功能稳定性。二糖可以明显提高抗体的稳定性。根据框架 H3223 /VL1247设计的重组抗体显示出高稳定性 , 这种抗体芯片可以在干燥的情况下保持 6个月以 上

6、。抗体芯片的优点是能高通量、特异性、高灵敏的鉴定抗体与靶蛋白之间的反应 , 需要的 样品体积小 , 在样品有限的情况下尤其重要 , 为了进一步减少所需要的样品量 , 可以使用微流 系统制造高密度的芯片 , 这个方法既可以将抗体局限 , 又可以将少量样品传送到指定的位置。 尽管抗体芯片有很多优点 , 但是也存在很大的局限性 :难以获得大量多样性的抗体分子 ; 蛋白 质标记是抗体芯片的瓶颈。抗体芯片上的抗体结合的表面积大 , 与样品蛋白结合时会出现交 叉反应 , 因此 , 尽管抗体可以识别特异的表位 , 但不能保证一定与目的蛋白结合 2。4. 抗体芯片的应用4.1 抗体芯片在检测尿液中吗啡含量的应

7、用抗体芯片竞争抑制法检测尿液中的吗啡含量具有灵敏度高 , 特异性好、操作简单、高通 量等优点 , 可用于法医毒物检测、戒毒效果监测。运用抗体芯片检测尿液中的吗啡及其代谢 物含量需要的样品仅 4l, 试验基于抗原抗体反应原理 , 其特异性高 , 且操作简单、耗时少。 吗啡是小分子有机化合物 , 其本身不具备免疫原性 , 必须共价地结合在大分子的蛋白上才能 进行基于免疫反应原理的检测 , 经过修饰的吗啡分子碳环上 C3、 C6与 BSA 结合 , 形成吗啡 2BSA 复合物可以作为免疫原免疫动物产生成抗体。 竞争抑制试验是将吗啡抗体固定在琼脂糖膜包 被的玻片上制备成抗体芯片 , 采用荧光标记 BS

8、A2吗啡复合物与待测样本进行竞争抑制反应。 由于固相抗体结合位点有限 , 待测样品中吗啡越多 , 结合的抗体位点就越多 , 而留给 Cy32吗啡 2BSA 与抗体结的位点越少 , 检测到的荧光信号弱 , 而反之则荧光信号强 , 用共聚焦芯片扫描仪 采集反应图象并进行图像分析 , 并以此间接推断出待检样品中吗啡的含量。抗体芯片广泛用2于研究细胞功能和蛋白质之间相互作用 , 具有高通量的优势 , 并能定量检测溶液中的目标蛋 白质。 虽然抗体芯片技术仍处在初期研究中 , 但其表现出灵敏度高 , 特异性好、 操作简单及筛 选高通量等优点 , 为法医毒物检测、戒毒监测提供了一种新的检测手段 3。4.2

9、抗体芯片在慢性肾脏病患者尿液细胞因子检测中的应用各种慢性肾脏病进行性发展的共同结局是终末期肾病 (ESRD,ESRD已成为严重威胁人 类健康的常见病 , 目前的肾脏替代治疗虽然获得了长足的进步 , 但是 ESRD 仍有较高的死亡率 , 其治疗费用已成为严重的社会负担。 如何早期发现慢性肾脏病 ( CKD 并采取有效措施延缓其 进展至 ESRD, 已成为人类面临的严峻挑战。 CKD 慢性进展的实质是肾脏纤维化 , 研究已经证实 它与肾脏产生的多种细胞因子、生长因子的作用有关 , 然而临床上尚缺乏早期、动态监测肾 脏纤维化进程的有效方法。蛋白组学时代的到来以及相关技术的出现 , 为我们探讨此问题提

10、 供了崭新的技术平台。 应用一种全新的蛋白组学技术抗体芯片技术检测 CKD 患者尿液中 细胞因子的变化。 应用 Raybiotech 人类细胞因子抗体芯片 , 依据试剂盒中操作手册进行操作 , 同时检测各组尿液中细胞因子水平。 在此基础之上 , 选取 2种有表达差异的细胞因子 , 应用经 典的 ELISA 方法进行定量分析 , 以验证细胞因子抗体芯片技术的可靠性。抗体芯片技术能够 高通量、 平行性检测尿液中多种细胞因子的表达水平。 抗体芯片所得到的半定量数据能够真 实反应尿液细胞因子的水平。 抗体芯片检测结果提示 CKD 患者尿液中细胞因子表达水平同正 常对照组有明显差异并且同疾病所处阶段有一

11、定的关系。 抗体芯片技术有可能成为监测慢性 肾脏病进展的新型技术平台 4。4.3 蛋白芯片技术在自身抗体检测中的应用通过蛋白芯片技术与间接免疫荧光法 ( F 和酶联免疫吸附法 (ELISA自身抗体检测试 剂盒进行比对 , 验证抗核抗体谱检测蛋白芯片 (抗 SSA-52抗体、 抗 SSA-60抗体、 抗 SSB 抗体、 抗 Sm 抗体、抗 RNP 抗体、抗 Scl-70抗体、抗 Jo-1抗体、抗 dsDNA 抗体、抗 rRNP 抗体、抗 着丝点抗体和抗核抗体 在临床应用中的敏感性和特异性 . 除抗 Jo-1抗体阳性样品较罕见 , 仅检测阳性样品 32份 , 其他 10种自身抗体 , 每种选择各阳

12、性样本 70份 , 阴性样本 294份 ; 并 对检测结果进行统计学分析 . 结果 除抗 SSA52抗体和抗 SSB 抗体的检测敏感度分别为 95.7? 和 98.6? 外 , 其他 9种自身抗体的检测敏感度均为 100,除抗 SSB 抗体、抗 RNP-68抗体、抗 Scl-70抗体、抗 dsDNA 抗体、抗 CENP-B 抗体、抗核抗原提取物抗体 (ANA的检测特异度分 别为 98.0? 、 98.0? 、 99.7? 、 99.7? 、 99.7? 、 98.3? 外 , 其他 5种自身抗体的检测特异度均为 100?. 结论 蛋白芯片技术检测 11种抗核抗体谱自身抗体的检测敏感度 (均&g

13、t;95.0 和特异度3(均>98.0 均较高 , 且与 F 和 ELISA 法有较高的符合率 , 能满足临床检测自身抗体谱的要求 . 此外 , 蛋白芯片技术检测自身抗体时具有高通量、简单快速、敏感度好和特异度强等优点 , 值得临床推广应用 5。4.4 抗体芯片在肿瘤研究中的应用卵巢癌肿瘤标志物的检测:卵巢癌发病率尤其居女性生殖器官肿瘤的第 2位,占妇科恶 型肿瘤的 25%。因其早期症状不明显,不易早期诊断,所以用肿瘤标记物抗体芯片进行检测 以观察这种检验方法的价值。 肝癌肿瘤标志物的检测:用肿瘤标志物抗体芯片系统测定 50例肝癌患者, 50例乙型肝炎患者或肝硬化患者及 50例正常对照人

14、群血清中 12种常见的肿瘤标 记物, 结果 50例肝癌患者血清中有 46例血清肿瘤标记物为阳性 (阳性率为 92% , 50例乙型肝 炎或肝硬化患者血清中 18例血清肿瘤标记物为阳性 (阳性率为 36% , 50例正常对照血清中有 2例血清出现肿瘤标记物阳性(阳性率 为 4% ,说明肿瘤标志物抗体芯片能提高肝癌诊断的 准确度。 胰腺癌肿瘤标志物的检测:用肿瘤标志物抗体芯片检测 42例胰腺癌患者, 35名健 康体检者, 51例胰腺良性疾病患者的 12种常见的血清肿瘤标志物, 结果显示, 抗体芯片检测 系统的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测法分别为 78.6%、 79.1%、 64.7%、 8

15、8.3%,正 常人组和胰腺良性疾病组检测结果的一致率分别达到 100%和 95%。说明肿瘤标志物抗体芯片 对胰腺癌的诊断具有较高的可靠性。 肺癌肿瘤标志物的检测:用肿瘤标志物抗体芯片对肺 癌患者、正常人及良性肿瘤血清的 CEA , NSE , CA242, CA153等肿瘤标志物进行检测,阳性率 分别为 80%, 3.3%, 6.6%,另外,采用常规检测仪器定量与抗体芯片检测作比较,表明抗体 芯片的反应强度与血标本中含量具有较好的相关性。 白血病 CD 抗原 (免疫组型 的检测:不 同的白血病细胞在他们的质膜上表达 247个特定的区别抗原 (CD 抗原 , 这些抗原的检测用流 式细胞仪只能辨认

16、 3个抗原,但是运用抗体芯片能同时检测 50种甚至更多的在白细胞及白血 病细胞上的 CD 抗原 6。5. 展望抗体芯片技术毫无疑问在肿瘤的研究中有非常重要的应用价值, 尤其对肿瘤标志物的检 测, 有助于恶性肿瘤的早期诊断、 分型和治疗监测。 但由于抗体芯片在技术及应用中仍存在 许多问题,未来的发展将集中在以下几个方面 :快速、廉价、高通量的制备抗体。单克隆 抗体是最重要、 最普遍的, 市场上可以提供几万个单克隆抗体, 但是对大量的蛋白质的研究 还是不够。 重组抗体则具有分子量小,数目庞大, 特异性高的特点,可由噬菌体抗体库技术 生产, 可提供 1011到 1012种抗体。 延长保质期, 便于推广。 抗体在包被 8个月后就不能4保持最佳的活性状态,人工合成的抗体则稳定性较高。加大芯片摄取蛋白的数目及种类, 尽可能多的捕获蛋白组信息, 实现高通量。 提高肿瘤标志物抗体芯片准确度, 可通过联合 更多的标记物加以改进。 目前国内外学者开展了大量的研究, 如对 CA199、 CEA 、 CA724的联 合肿瘤标记以及 CA199、 CEA 、 HCGA 的联合肿瘤标记制备成抗体芯片以提高对胃肠恶性疾病 的诊断。参考文献1吕晓娟 , 祁海柱 , 李景辉等 . 抗体芯片的研究进展 J.科技信息 ,2009,(02.2孙 平 , 张 逢 春 , 张 影 . 蛋 白 质 芯 片 技 术 的 研