表面微生物检测方法[1]

1、空气、食品接触面微生物检验方法、检验标准1、 目的：检测生产车间空气、操作人员手部、与食品有直接接触面的机械设备的微生物指标，生产区域环境当中病原微生物的监控，达到规定标准，以控制食品成品的质量。2、 参照标准：中华人民共和国国家标准一次性使用卫生用品卫生标准GB159791995、HACCP原理与实施、中华人民共和国国家标准公共场所空气微生物检验方法细菌总数测定GB/T 18204.12000、中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN 0169-92/SN 0172-92/ SN 0170-92、 出入境检验检疫局二000四年出入食品微生物检验培训教材中出入食品生产厂卫生细菌检验方法、日本东

2、京冷冻食品检验方法。3、 采样与检测方法：3.1空气的采样与测试方法3.1.1样品采集：(1)取样频率：a)车间转换不同卫生要求的产品时，在加工前进行采样，以便了解车间卫生清扫消毒情况。b)全厂统一放长假后，车间生产前，进行采样。c)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间进行采样，如有检验不合格点，整改后再进行采样检验。d)实验性新产品，按客户规定频率采样检验。e)正常生产状态的采样，每周一次。（2）采样方法在动态下进行，室内面积不超过30 m2，在对角线上设里、中、外三点，里、外点位置距墙1 m；室内面积超过30 m2，设东、西、南、北、中五点，周围4点距墙1 m。采样时，将含平板计数琼脂培

3、养基的平板(直径9 cm)置采样点(约桌面高度)，并避开空调、门窗等空气流通处，打开平皿盖，使平板在空气中暴露5 min。采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过6h，若样品保存于04条件时，送检时间不得超过24h。3.1.2菌落培养：（1）在采样前将准备好的平板计数琼脂培养基平板置37±1 培养24 h，取出检查有无污染，将污染培养基剔除。（2）将已采集样品的培养基在6 h内送实验室，细菌总数于37±1培养48h观察结果，计数平板上细菌菌落数。（3）菌落计算：a) 记录平均菌落数，用“个/皿”来报告结果。用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用51

4、0倍放大镜检查，不可遗漏。b) 若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2 个或2个以上菌落计数。3.2工作台（机械器具）表面与工人手表面采样与测试方法：3.2.1样品采集：(1)取样频率：a)车间转换不同卫生要求的产品时，在加工前进行擦拭检验，以便了解车间卫生清扫消毒情况。b)全厂统一放长假后，车间生产前，进行全面擦拭检验。c)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间可疑处进行擦拭，如有检验不合格点，整改后再进行擦拭检验。d)实验新产品，按客户规定擦拭频率擦拭检验。e)对工作表面消毒产生怀疑时，进行擦拭检验。f)正常生产状态的擦拭，每周一次。（2） 采样方法： a) 工作台（机械器具

5、）：用浸有灭菌生理盐水的棉签在被检物体表面（取与食品直接接触或有一定影响的表面）取25cm2 的面积，在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。b) 工人手：被检人五指并拢，用浸湿生理盐水的棉签在右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。（3）采样注意事项：擦拭时棉签要随时转动，保证擦拭的准确性。对每个擦拭点应详细记录所在分场的具体位置、擦拭时间及所擦拭环节的消毒时间3.2.2 细菌·大肠菌群的检测培养:样液稀释：将放有棉棒的试管充分振摇。此液为1：10稀释液。如污染

6、严重，可十倍递增稀释，吸取1ml 1：10样液加9ml无菌生理盐水中，混匀，此液为1：100稀释液。 3.2.2.1 细菌总数：（1）以无菌操作，选择12个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿（平行样），将已融化冷至45左右的平板计数琼脂培养基倾入平皿，每皿约15ml，充分混合。（2）待琼脂凝固后，将平皿翻转，置36±1 培养48 h后计数。（3）结果报告：报告每25cm2食品接触面中或每只手的菌落数 3.2.2.2大肠菌群：（1）平板法:a) 以无菌操作，选择12个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿（平行样），将已融化冷至45左

7、右的去氧胆酸盐琼脂培养基倾入平皿，每皿约15ml，充分混合。待琼脂凝固后,再覆盖一层培养基，约3-5 ml。b) 待琼脂凝固后，将平皿翻转，置36±1 培养24h后计数。c) 结果计算： 以平板上出现紫红色菌落的个数乘以稀释倍数得出。d) 结果报告：报告每25cm2食品接触面中或每只手的菌落数（2）试管法:a) 以无菌操作，选择3个稀释度各取1ml样液分别接种到BGLB肉汤培养基中，每个稀释度接种三管。b) 置BGLB肉汤管于36±1培养48±2h。记录所有BGLB肉汤管的产气管数。c) 结果报告：按BGLB肉汤管产气管数，查MPN表报告每25cm2食品接触面中或

8、每只手的大肠菌群值。3.2.3 金黄色葡萄球菌检测（1）定性检测a) 取1ml 稀释液注入灭菌的平皿内，倾注15-20ml的B-P培养基，（或是吸取0.1稀释液，用L棒涂布于表面干燥的B-P琼脂平板），放进36±1的恒温箱内培养48±2小时。b) 从每个平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌的菌落作血浆凝固酶实验。c) 结果报告：B-P琼脂平板的可疑菌落作血浆凝固酶实验为阳性，即报告手（工器具）上有金黄色葡萄球菌存在。（2）定量检测a) 以无菌操作，选择3个稀释度各取1ml样液分别接种到含10氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，每个稀释度接种三管。b) 置肉汤管于36±

9、1的恒温箱内培养48小时。划线接种于表面干燥的B-P琼脂平板，置36±1 培养4548小时。c) 从B-P琼脂平板上，挑取典型或可疑金黄色葡萄球菌菌落接种肉汤培养基，36±1培养2024小时。d) 取肉汤培养物做血浆凝固酶试验，记录试验结果。e) 报告结果：根据凝固酶试验结果，查MPN表报告每25 cm2食品接触面中或每只手的金黄色葡萄球菌值。3.3工厂环境中病原体的检测计划与方法检测计划：为了保证食品安全，工厂应该对生产环境中的病原微生物进行检测和评估，检测项目包括李斯特菌，沙门氏菌等病原体微生物，化验室应该按照一定的计划对生产场所环境中的病原体进行检测，其中包括地面、下

10、水道、 排水沟、墙壁、天花板、设备框架、运输的支架，冷藏装置、速冻机、传送带、设备的螺丝、维修工具等部位。当某个点检测到病员微生物时，应该对环境中的相似点加大检测频率；在把所有的预定点检测完后，应该对环境中的病原微生物的存在状况进行全面评估，在下一次环境检测循环过程中加强检测容易出现病原体的环境点，达到持续改进的目的。检测频率: 每月两次,每次每个区域至少选取5个检测点,分别进行检测。3.3.1 环境李斯特菌的检测方法（3MTM PetrifilmTM 环境李斯特菌的测试片）3.3.1.1 用涂抹棒，海绵或者其他采样设备收集环境样本。3.3.1.2 将收集的样本添加10毫升灭菌的缓冲蛋白胨水，

11、将样本与缓冲蛋白胨混合1分钟，将样品置于室温（20-30）1小时，最久不超过1.5小时，以修复损伤的李斯特菌。3.3.1.3 将测试片放在平坦处，掀起上层膜。3.3.1.4 用移液器垂直滴加3毫升样品到下层膜中央，将上层膜缓慢盖下，以免产生气泡。3.3.1.5 轻轻将塑料压板放在位于接种区上层膜上，不要压，扭转或者滑动压板。提起压板等至少十分钟，以使胶体凝固。3.3.1.6 将测试片透明面朝上，可叠放至十片，在37±1培养26-30小时，可以用标准菌落记数器或者其他光学放大器判读，不要记数圆形轮廓上的菌落，因为他们不受选择性培养基的影响。3.3.1.7 对于定性检测，根据紫红色菌落是

12、否存在，结果记为检出或者未检出。3.3.2 环境中沙门氏菌的检测方法3.3.2.1采样地点: 选取采样点时因尽量选取微生物容易滋生的地方 冷冻车间FD车间东区初加工传递窗口表面、排水沟、排水沟出口、墙壁、地面卸料间墙壁、墙角、地面、天花板、物料车表面东区精加工地面、墙壁、墙角、排水沟、排水沟出口、速动机链条、天花板暂存间墙壁、地面、天花板、墙角、墙缝西区初加工传递窗口表面、地面、墙壁、排水沟、排水沟出口挑选间墙壁、地面、天花板、墙角、垫板西区精加工地面、墙壁、墙角、排水沟、排水沟出口、速动机链条、天花板包装室墙壁、地面、天花板、金探传送带表面、落地料存放处3.3.2.2 操作步骤3.3.2.2

13、.1采样应在生产开始后进行，用已浸润过的棉拭在选定的被测表面旋转涂抹约100cm2的面积，然后将棉拭放回涂抹试管并盖紧。 3.3.2.2.2将样品带回实验室，每5个点混合成一个样品, 登记编号,按照SN0170-92标准及时检测，若有阳性结果出现，应逐步对所混合的每个点分别检测。物体表面涂抹菌落总数计算方式：物体表面细菌总数（cfu/c）=平皿上菌落的平均数*采样液稀释倍数/采样面积（cm2）根椐GB159792002一次性卫生用品卫生标准的标准,生产环境卫生指标1 装配与包装车间空气中细菌菌落总数应2 500 cfu/m3。2 工作台表面细菌菌落总数应20 cfu/cm2。3. 工人手表面细

14、菌菌落总数应300 cfu/只手，并不得检出致病菌。人员和环境卫生检测方法一、        空气采样及检验方法1培养基：普通营养琼脂平板，按GB4789.28中3.7条配制2采样（空气沉降法）2.1布点：面积小于30平方米的车间，设一对角线，在线上取3点，即中心一点，两端在距墙1米处各取一点；面积大于30平方米的车间，设东、西、南、北、中5个点，其中东、西、南、北点均距墙1米。2.2采样高度：与地面垂直高度80-150厘米。2.3采样方法；用直径为9厘米的普通营养琼脂平板在采样点上暴露20分钟盖上送检培养。3培养：于37培养24小时

15、。4检测频率：每周空气质量标准：生车间、熟车间、成品车间：低于100个半成品库、成品库：低于10个二、设备的采样与检验方法根据生产过程所要求的重点卫生部位，实验室对其进行涂抹采样，进行细菌总数检验。1采样方法1.1涂抹法（适用于表面平坦的设备和工器具产品接触面）取经过灭菌的铝片框（框内面积为50平方厘米）放在需检查的部位上，用无菌棉球蘸上无菌生理盐水擦拭铝片中间方框部分，擦完后立即将棉球投入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。1.2贴纸法（适用于表面不平坦的设备和工器具接处面）将无菌规格纸（5×5厘米，纸质要薄而软）用无菌生理盐水泡湿后，于需测部分分别贴上两张

16、，两张纸面积共50平方厘米，然后取下放入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。2检验方法2.1细菌总数的检验将上述样液充分振摇，根据卫生情况，相应地做10倍递增稀释，选择其中2-3个合适的稀释度作平皿倾注培养，培养基用普通营养琼脂，每个稀释度作2个平皿，每个平皿注入1毫升样液，于37培养24小时后计菌落数。结果计算表面细菌总数（cfu/cm2）=平皿上菌落的平均数×样液稀释倍数/30×22.2致病菌的检验沙门氏菌，参照GB4789.4进行金黄色葡球菌，参照GB7918.5进行4.检验合格标准：细菌总数10100个cm2，5.关键点：细菌总数10个cm2

17、一般区域：细菌总数100个cm2三、人员手表面细菌污染情况的检验1.        采样方法：用一支蘸有无菌生理盐水的棉拭子涂擦被检对象手的全部，反复两次，涂擦的时候棉拭子要相应地转动，擦完后，将手接触部分剪去，将棉拭子放入装有10毫升无菌生理盐水的试管内送检培养。2.        检验方法：同工器具表面细菌总数检验方法。3.        结果计算：每只手表面的细菌总数（cfu/只手）=平皿上菌落的平均数

18、5; 样液稀释倍数四、消毒液药效的微生物学鉴定法1采样对象：正常使用的消毒液，和已知配制好备用的消毒液2采样及检验方法在无菌条件下，用无菌吸管吸取1毫升样液，加入9毫升稀释液中混匀，对于醇类与酚类消毒剂，稀释液用普通营养肉汤即可；对于含氯消毒剂、含碘消毒剂，需在肉汤中加入0.1%硫代硫酸钠，对洗必泰、季铵盐类消毒剂，需在肉汤中加入3%（W/V）土温80和0.3%卵磷脂；对醛类消毒剂，需在肉汤中加入0.3%甘氨酸；对于含有表面活性剂的各种复方消毒剂，需在肉汤中加入（W/V）土温80，以中和被检样液中的残效作用，将注入了样液的稀释液充分摇匀，取1毫升注入平皿，随之倒入普通营养琼脂，待琼脂凝固后，翻

19、转平皿，将平皿于37条件下培养24小时后计平板上生长的菌落数。3结果分析平板上有菌生长，表明被检样液中有残存活菌，若每个平板菌落数在10个以下，仍可用于消毒，若每个平板菌落数超过10个，说明每毫升被检样液含菌量已超过100个，即不宜在用于消毒。该公式是一个经验公式.它的理论模式依据是:100CM2的面积上10MIN降落的菌落数,等于1升空气中所含的细菌总数.系数50000基于上述假说和单位换算而来.细菌总数(CFU/M3)=5/10T*100/A*1000*N=50000*N/AT    5/10T:实际放置了5MIN;    100/A:A单一培养皿面积;    1000:1M3=1000L啊,换算成m31、空气细菌落菌数单位既然是cfu/m3，那采样时应该还要记录放置平皿的高度。2、食品安全管理体系中罐头行业有个标准如下：   落下菌数