生物化学酶刘博整理

1、第五章 酶第一节 导 言一、 酶的概念（一）酶是生物催化剂酶是活细胞产生的，具有催化生物反应功能的蛋白质大分子及核酸。 酶生物催化剂：蛋白质类： Enzyme (天然酶、生物工程酶) 克隆酶、遗传修饰酶蛋白质工程新 核酸类：Ribozyme ; Deoxyribozyme 模拟生物催化剂酶催化的生物化学反应，称为酶促反应(Enzymatic reaction)。在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物(substrate)。胞外酶与胞内酶 酶虽是由细胞产生的,但并非必须在细胞内才能起作用,有些酶被分泌到细胞外才发生作用。这类酶称“胞外酶”。大部分酶在细胞内起催化作用称为“胞内酶”。（二）酶的化

2、学本质1酶是蛋白质1926年Sumner第一次从刀豆种子中提取了脲酶结晶，证明其具有蛋白质性质。30年代，Northrop又分离出结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶，证明酶的化学本质是蛋白质。酶的相对分子质量大；酶具有蛋白质的特性如：两性解离、胶体性质、加热使酶变性、颜色反应等；酶可以被蛋白酶水解而丧失活性；许多酶的氨基酸顺序已被测定；969年人工合成了牛胰核糖核酸酶。2. Ribozyme的化学本质是RNA在已鉴定过的数千种酶中，绝大多数酶的化学本质是蛋白质。但在1982年，美国科学家T.Cech发现原生动物四膜虫的26SrRNA前体具有自我拼接的催化活性。T.Cech将这种RNA命名为

3、“Ribozyme”。核酶（ Ribozyme ）：指对RNA具有催化活性的RNA 。二、酶的催化特性（一）与无机催化剂相比，有如下共同点：反应前后都不发生数量和质量变化；能加快反应速度,但不改变反应的平衡点；都能降低反应所需的活化能；需要量小。（二）酶的作用特点极高的催化效率，高度的专一性，易失活（蛋白质变性），活性可调控（激活、抑制），常需辅助因子（辅酶、辅基等）1.极高的催化效率反应速度与不加催化剂相比可提高1081020，与加普通催化剂相比可提高1071013。脲酶的催化效率比Fe粉高1015倍。反应式如2H2O2 -2H2O + O2 以转换数作为标准，来比较其效率 用铁离子， 6

4、x 10 -4 mol/mol.s 转换数（turnover number） ：每个酶分子每分钟催 血红素， 6 x 10 -1 mol/mol.s 化底物的分子数。 H2O2 酶， 3 6 x 10 6 mol/mol.s 碳酸酐酶 96000万2.高度的专一性一种酶只能作用于某一类或某种特定的物质，这种性质称为酶的专一性。（1） 结构专一性 概念：酶对所催化的分子化学结构的特殊要求和选择。 类别：绝对专一性和相对专一性（2） 立体异构专一性 概念：酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求 类别：旋光异构专一性和几何异构专一性绝对专一性：有些酶只作用于一种底物，催化一个

5、反应， 而不作用于任何其它物质。 如：过氧化氢酶底物：过氧化氢。琥珀酸脱氢酶底物：琥珀相对专一性：这类酶对结构相近的一类底物都有作用。包括键专一性和基团专一性。键专一性：只要求作用于一定的化学键，而对键两端的基团无严格的要求。酯酶（酯键） 二肽酶（肽键）13消化道内几种蛋白酶的专一性14旋光异构专一性：当底物具有旋光异构体时一种酶只能作用于其中的一种。如：L-AA氧化酶只能催化L-AA氧化，而对D-AA无作用。 顺反异构专一性：对具有顺式和反式异构的底物具严格的选择性。；例15三、 酶的组成（一）酶的组成单纯酶 (simple enzyme)结合酶 (conjugated enzyme)：全酶

6、 holoenzyme ：蛋白质部分（酶蛋白 apozyme）全酶=酶蛋白+辅助因子 非蛋白部分：小分子有机化合物 (辅助因子cofactor) 金属离子辅因子：辅酶、辅基、金属离子 辅酶：与酶蛋白结合疏松，可以用透析法除去。 辅基：与酶蛋白结合紧密，不能用透析法除去。辅基和辅酶多为维生素参与形成的小分子有机物。金属离子：与酶蛋白结合。结合酶(全酶)的特点: 只有全酶才有催化活性。一种酶蛋白只结合一种辅助因子，而一种辅助因子可结合多种酶蛋白。酶蛋白决定反应专一性，高效催化作用；辅助因子决定反应的种类和性质。（二）酶的结构1.酶的结构与蛋白质的结构相同，是具有一定空间结构的蛋白质。2.根据酶蛋白

7、的结构特点，酶可分为：1)单体酶: 只有一条多肽链,分子量在13,000-35,000之间，一般是水解酶, 如蛋白酶、羧肽酶。2)寡聚酶：由两个或两个以上的亚基组成,亚基之间由非共价键相连，亚基可以是相同的,也可以不同，分子量在35,000-几百万，如丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶。3)多酶体系：由几个酶有组织的聚集在一起,功能上相互配合，第一个酶的产物是第二个酶的底物，如丙酮酸脱氢酶、脂肪酸合成酶。（三） 酶的命名习惯命名：来源 + 底物 + 酶(字) 例 胃蛋白酶 底物 + 反应性质 + 酶(字) 例 乳酸脱氢酶系统命名：所有底物反应性质 如：琥珀酸：FAD氧化还原酶 例21第二节 酶的分类酶的分

8、类 国际E学委员会制定的“国际系统分类法”将酶促反应分为六大类:1.氧化还原酶：催化氧化还原反应的酶。例 乳酸脱氢酶催化乳酸的脱氢反应232.转移酶：催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应：243.水解酶：:催化催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶催化的脂的水解反应：254.裂合酶：催化从底物上移去某些基团而形成双键的非水解性反应及其逆反应的酶。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。265.异构酶：催化同分异构体的相互转变，即底物分子内基团或原子的重排过程

9、的酶。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。276.合成酶：又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。 如：Gln合成酶, 丙酮酸羧化酶。 A + B + ATP AB + ADP + Pi第三节 酶的结构与功能的关系一、酶的一级结构与功能的关系（一）必需基团（essential group）概念: 酶蛋白中一些与酶的活性密切相关的基团，称酶的必需基团。常见的必需基团：His 的咪唑基、Ser/Thr 的羟基、Cys 的巯基、Glu 的羧基等。(二) 酶原与酶原的激活1.概念：（1）酶原（zymogen） ：有些酶在细胞内合成

10、或初分泌时，或在其发挥催化功能前只是酶的无活性前体，称为酶原。（2）酶原的激活：在一定条件下，酶原结构发生改变，转化为有活性的酶的过程。实质：酶原被修饰后，形成了正确的分子构象和活性中心，由此可见酶分子的特定结构和酶的活性中心的形成是酶分子具有催化活性的基本保证。2.酶原激活的机理酶原在特定条件下一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽，分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心34 35酶原激活的生理意义避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。二、酶的

11、活性与其高级结构的关系（一）酶的活性中心(active center )概念：在酶分子中由必需基团在空间结构上相互靠近，形成具有特定空间结构的区域，该区域能与底物特异性结合并将底物转化为产物，称为活性中心或 活性部位。活性中心：结合部位（与底物结合，决定酶的专一性） 催化部位（底物的敏感键在此处断裂而形成新键，决定酶的高效性及反应性质）溶菌酶的活性中心：谷氨酸35和天冬氨酸52是催化基团；色氨酸62和63、天冬氨酸101和色氨酸108是结合基团；色氨酸62和63、天冬氨酸101和色氨酸108是结合基团；（二）核糖核酸酶1.变性：构象被破坏，活性中心被破坏，失去生物学活性。2.催化：具有天然构象

12、的核糖核酸酶在底物的诱导下，构象发生一定改变，形成了正确的活性中心，使酶发挥了催化作用。（三）聚合与解聚（四）同工酶(isoenzyme)能催化相同的化学反应，但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。例 乳酸脱氢酶（LDH）43研究意义：作为遗传的标志；作为临床诊断指标；研究某些代谢调节机制。应用于农业育种等。，不同组织中LDH同工酶的电泳图谱44第四节 酶的作用机理一、酶促反应的本质（一）酶的催化作用与分子活化能 化学反应自由能方程式G =H -TS（G是总自由能的变化， H 是总热能的变化，S是熵的变化）当G0，反应不能自发进行。当G0，反应能自发进行。活化能

13、：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，1mol 反应物全部进入活化状态所需的自由能。加快反应速度的方法：供给能量，如加温、光照等降低活化能酶和一般催化剂的作用就是降低化学反应所需的活化能，从而使活化分子数增多，反应速度加快。（二）酶与反应的过渡态互补酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。Pauling提出过渡态理论认为：E与S的过渡态互补，亲和力最强，释放的结合能使反应活化能降低，有利于S 跨越能垒，使反应加速。 证明：人工合成了过渡态类似物；用过渡态类似物制备

14、出抗体酶。50中间产物学说 E+S可逆ESEP中间产物存在的证据：1同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；2吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合） ；3电镜直接观察。吸收光谱的变化可证明：H2O2酶（含铁卟啉）：红褐色，在645、583、498nm处有光吸收； H2O2 -E加H2O2后：酶液由褐转红，增加了561、530nm光吸收带，说明有新物质；H2O2 + E 若加入氢供体（焦性没食子酸）后：二条新带消失。H2O2 -E + AH2 A +E+ 2H2O二、酶反应机制（一）诱导契合学说（Koshland，1958）：酶活性中心的结构有一定的灵活性，当底物与酶分子结合时，受底物分

15、子的诱导, 酶蛋白的构象发生了有利于与底物结合的变化，使反应所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向，转入有效的作用位置，这样才能使酶与底物完全吻合，结合成中间产物。（酶专一性的“诱导契合学说”）“锁钥学说”（Fischer，1890）：酶的活性中心结构与底物的结构互相吻合，紧密结合成中间络合物。（二）使酶具有高催化效率的因素酶分子为酶的催化提供各种功能基团和形成特定的活性中心，酶与底物结合成中间产物，使分子间的催化反应转变为分子内的催化反应。1. 邻近定向效应酶与底物结合成中间产物过程中，底物分子从稀溶液中密集到活性中心区，并使活性中心的催化基团与底物的反应基团之间正确定向排列所产生的效应。

16、使分子间反应变为分子内反应的过程。2. “张力”与“形变”酶与底物的结合，不仅酶分子发生构象变化，同样底物分子也会发生扭曲变形，使底物分子的某些键的键能减弱，产生键扭曲，降低了反应活化能。3. 酸碱催化通过向反应物（作为碱）提供质子或从反应物（作为酸）夺取质子来达到加速反应的一类催化。（广义酸碱催化，Bronsted的酸碱定义）蛋白质中起酸或碱催化的功能基团有氨基、羧基、咪唑基、巯基和酚基。影响酸碱催化反应速度的两种因素：（1）酸或碱的强度（pK）；（2）质子传递的速度。His的咪唑基最活跃。组氨酸的咪唑基：（1） pK值约为6.7-7.1，在接近中性的条件下，一半以广义酸的形式存在，另一半以

17、广义碱的形式存在，因而它既能作为质子供体，又能作为质子受体，有效地进行酸碱催化。（2）咪唑基供出和接受质子的速度很快，其半衰期短，小于0.1毫微秒。所以许多酶活性中心都有组氨酸残基。 酶分子中可作为酸硷催化的功能基团614.共价催化催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。酶中参与共价催化的基团主要包括 His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羟基等。某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。 5.酶活性中心是低介电区域可排除高极性的水分子，使S的敏感键与E的 催化基团有高反应力，从而加速反应

18、。第五节 酶促反应动力学一、酶促反应的基本动力学酶促反应动力学的概念：研究酶促反应速度及其影响因素，并加以定量的阐述。其中酶与底物之间的作用问题是研究酶促反应的核心问题。影响因素：包括：酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定（一）底物浓度的影响 底物浓度对酶反应速度的影响65用中间产物学说解释底物浓度与反应速度关系曲线的二相现象：E+S可逆ESEP当底物浓度很低时，有多余的酶没与底物结合，随着底物浓度的增加，中间络合物的浓度不断增高。当底物浓度较高时，溶液中的酶全部与底物结合成中间产物，虽增加底物浓度也不会有更多的中间产物生成。（二）米氏方程-定

19、量表达底物浓度与酶反应速率的关系1913 年Michaelis 和Menten 提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程。米氏方程式： K1 K3中间产物学说:E+S ®¾¬ ES ®¾¾ E+P K2 VmaxS米氏方程（Michaelis-Menten equation）V= ¾¾¾¾ Km + S 米氏方程解释底物浓度对反应速度的影响规律米氏方程式推导过程:稳态：是指 ES 的生成速度与分解速度相等，即 ES 恒定 K1 ( EES) SK2 ES + K3 E

20、S v= K3 ES （1）整理得：（EES）S K2+K3 令:¾¾¾¾ = ¾¾¾¾ = Km (米氏常数) （2）ES K1则(2)变为: （EES）S Km ES整理得: ES K3ESES（3）将(3) 代入 (1) 得 V （4）Km+S Km+S当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即EES,反应达最大速度VmaxK3ESK3E (5)将(5)代入(4)得米氏方程式: VmaxS 71V1. Km 的求法 Km+S(1)双倒数作图法(又称林-贝氏作图）VmaxS KmV 两边同取倒数 1/V=1/

21、S +1/VmaxKm +S Vmax (2) Hanes 作图法：在林贝氏方程基础上，两边同乘 S 72（3）Eddie-Hofstee作图法（v 法）v Km+ vS = Vmax ·S v S = Vmax S - v Km v = vmax Km 74（4）Eisenthal和Cornish-Bowden法 (Direct linear plot ) 75 2. 米氏常数的意义及测定v = Vmax/ 2，则： km= S意义：（1） km是酶的一个基本的特征常数。其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且随着温度、pH和离子强度而改变。 （2）从km可判断酶的专一性和天然

22、底物。 Km最小的底物，通常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。 （3）当k2k3时， km的大小可以表示酶与底物的亲和性。 K1 K3E+S ®¾¬ ES ®¾¾ E+P km= （k2 +k3)/k1 Km k2 / k1 SE K2 km可以看作ES的解离常数ks ：km= ks = 当km大时，说明ES容易解离，酶与底物结合的亲和力小。 ES（4）从km的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度。实际用途：可由所要求的V求S；例：求反应速度达最大反应速度90%时的底物浓度。从米氏方程中求得：当反应速度达到最大反应速度的90

23、%，则 Vmax · S 90%V =100%VS/(km +S) 即 S = 9km v = （5）km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。 km + S+乳酸脱氢酶（1.7×10-5）®¾¾乳酸 丙酮酸+丙酮酸脱氢酶（1.3×10-3）®¾¾乙酰CoA +丙酮酸脱羧酶（1.0×10-3）®¾¾乙醛当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于km最小的酶。米氏常数可根据实验数据作图法直接求得：先测定不同底物浓度的反应初速度，从v与S的关系曲线求得Vmax ，然后

24、再从1/2 Vmax求得相应的S即为km（近似值）。注意： 米氏方程只是反映了底物单分子时酶反应速度与底物浓度之间的定量关系，但这个方程不适用包括一种以上的底物和其他物质的影响的酶反应。但可以根据这个方程推出各种复杂酶促反应的动力学方程。二 . 酶浓度对反应速度的影响 83当 S >> E 时，Vmax = k3 E 1）特征：成正比 2）条件：底物浓度足够大三、温度对反应速度的影响 841 . 特征：双重影响 3.特点：低温不变性，不是酶的特征性常数2 .最适温度 4. 应用：低温麻醉、低温保存酶制品酶的最适温度: 酶活性最高时的温度, 也即酶的催化效率最高, 酶促反应速度最大时

25、的温度。四、pH 对反应速度的影响 851. 特征：极端pH引起变性 3 .特点：不同酶不同pH不是酶的特征性常数2. 最适pH（optimum pH） 4.应用：在最适pH时进行酶促反应或测酶活性酶的最适pH : 酶催化活性最高时的pH。在一定的pH范围内酶是稳定的pH对酶作用的影响机制：过酸过硷导致酶蛋白变性, 影响底物分子解离状态, 影响酶分子解离状态,影响酶的活性中心构象五、激活剂对酶作用的影响凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。类别 金属离子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+ 、 Co2+、Fe2+ 阴离子： Cl-、Br

26、- 有机分子:还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：EDTA六、抑制剂对反应速度的影响抑制剂（inhibitor）：凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为抑制剂。区别于酶的变性: 1) 抑制剂对酶有一定选择性 (2) 引起变性的因素对酶没有选择性抑制作用的种类: 不可逆性抑制作用 可逆性抑制作用: 竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制酶的必需基团的性质受到某种化学物质的作用而发生改变，使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。b.能够与酶的活性中心或重要的必需基团以非共价或共价的

27、方式形成比较稳定的复合体或结合物。（一）不可逆性抑制作用概念：抑制剂以共价键与酶的活性中心上的 必需基团结合，使酶失活，且不能用透析、超滤等方法去除，这种抑制作用称为不可逆性抑制作用。类型：羟基酶的抑制 (1) 抑制剂：有机磷农药（敌敌畏、敌百虫、1059等） (2) 举例（酶）：胆碱酯酶（choline esterase）（3）解救：解磷定、阿托品（pyridine aldoxime methyliodide, PAM）羟基酶: 丝氨酸侧链上的羟基为必需基团的酶 92 （二）可逆性抑制作用(reversible inhibition)概念：抑制剂以非共价键与酶可逆性结合，使酶活性降低或消失，

28、用透析、超滤等方法可去除，使酶恢复活性，这种抑制作用称为可逆性抑制作用。类型: 竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制1.竞争性抑制作用（competitive inhibition）（1） 概念：抑制剂与酶的底物结构相似，可与底物竞争酶的活性中心，阻碍酶与底物形成中间产物，从而抑制酶的活性的现象。（2)反应模式: K1 (EI ®¾¬ I +）E+S ®¾¬ ES ®¾¾ E+P （3）* 特点 抑制剂与底物结构相似 两者都与酶的活性中心结合 抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力和与底物浓度的相对比例

29、增加底物浓度可减低或解除抑制作用 动力学变化：Vmax不变、Km 值变大(4）竞争性抑制的动力学方程: 竞争性抑制的特征曲线：97VmaxS 1 Km I 1 1 V = - = (1+ ) + Km(1+I/Ki)+S V Vmax Ki S VmaxVSv = kin=1+I /ki)+S 98km(1+I /ki)+S加入竞争性抑制剂后，Km 变大，酶促反应速度减小。Vmax不变。(5) * 举例 丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶 99 磺胺类药物抑制细菌二氢叶酸合成酶 100对氨基苯甲酸 二氢叶酸合成酶 二氢叶酸还原酶 二氢蝶呤 ®¾¾®¾

30、90; FH2 ®¾¾®¾¾ FH4 谷氨酸 磺胺药 (-) 氨甲蝶呤(-)2.非竞争性抑制作用（non-competitive inhibition）(1) * 概念：有些抑制剂可与酶的活性中心外的必需基团结合，不影响酶与底物的结合，酶与底物的结合也不影响酶与抑制剂的结合，但酶-底物-抑制剂复合物（ESI）不能生成产物，这种抑制作用称为非竞争性抑制。 K1(2)反应模式: (EI ®¾¬ I +）E+S ®¾¬ ES ®¾¾ E+P +S &#

31、174;¾¬ ESI ®¾¬®¾¬ I+(3)特点： K1抑制剂与底物结构不相似 抑制剂与酶在活性中心外的必需基团结合 抑制结果取决于抑制剂的浓度 增加底物浓度不能解除抑制作用 动力学变化：Vmax 变小、Km 值不变（4）非竞争性抑制的动力学方程: 非竞争性抑制的特征曲线：1 Km I 1 1 I - = (1+ ) + ( 1+ ) 104V Vmax Ki S Vmax Ki如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg）通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制；EDTA结合金属

32、离子引起的抑制作用也属于非竞争性抑制。非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的基团结合，这类抑制作用不会因提高底物浓度而减弱。3. 反竞争性抑制作用（uncompetitive inhibition）（1) * 概念：抑制剂仅与酶-底物复合物（ES）结合，使中间产物ES的量下降，从而既减少了产物的生成，又减少了从中间产物解离出游离酶和底物的量，称为反竞争性抑制。 (2)反应模式: K1 E+S ®¾¬ (ESI ®¾¬ I +）ES ®¾¾ E+P (3) * 特点： 抑制剂只与 ES 复合物结合 抑制结果取决于

33、抑制剂的浓度 增加底物浓度不能解除抑制作用 动力学变化：Vmax 变小、Km 值变小各种可逆性抑制作用的比较 作用特征 无抑制剂 竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制与结合的组分 E E,ES ES动力学参数Km Km 增大 不变 减小最大速度 Vmax 不变 降低 降低林-贝氏作图斜率 Km/ Vmax 增大 增大 不变 纵轴截距 1/ Vmax 不变 增大 增大横轴截距 -1/ Km 增大 不变 减小第六节 酶的多样性和活性的调节一、核 酶80年代初期，美国Cech和Altman各自独立地发现RNA具有生物催化功能，从而改变了生物体内所有的酶都是蛋白质的传统观念。这个发现曾被认为是近十多

34、年来生化领域内最令人鼓舞的发现之一。为此Cech和Altman共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。（一）核酶的催化性质RNA作用于RNA核酶催化的反应主要包括:水解反应(RNA限制性内切酶活性)，连接反应(聚合酶活性)和转核苷酰反应等。后来，核酶的其他作用底物也已被发现，如多糖、DNA以及氨基酸酯等。（二） 核酶的种类按作用底物方式不同分为，自然界现有（1）催化分子内反应的核酶，自我剪接(selfsplicing)核酶（四膜虫rRNA，需鸟苷和Mg2+） 自我剪切(self-cleavage)核酶 (不需鸟苷)（2）催化分子间反应(如原核生物RNaseP中的RNA)的核酶。（三）核酶的研究意义

35、及应用前景 1.基因治疗：根据锤头结构或发夹结构原理设计核酶基因，构建于特定的表达载体，在不同细胞内表达已经成功。结果表明核酶基因导入细胞或体内可以阻断基因表达，用作抗病毒感染，抗肿瘤的有效药物，前景诱人，应用将是广泛的。2.分子进化：具有催化功能RNA的重大发现，表明RNA是一种既能携带遗传信息又有生物催化功能的生物分子。因此，很可能RNA的出现早于蛋白质和DNA，是生命起源中首先出现的生物大分子，而一些有酶活性的内含子可能是生物进化过程中残存的分子“化石”。 （四）核酶的研究中的两个问题1核酶催化效率太低。2由于核酶本身是RNA，很容易被核酸水解酶(RNase)所破坏。因此，要将核酶应用于

36、体内阻断基因表达或作为抗病毒的临床药物，还要做大量的研究工作。二、调节酶(regulatory enzyme)通过改变自身活性来调节酶的活性，通常是通过酶分子结构的变化来改变其活性，进而调节代谢速度。（一）共价修饰酶（covalent modification enzyme)酶蛋白多肽链上某些氨基酸侧链基团，在某种酶的催化作用下，发生了可逆的化学修饰，分子共价连接（或脱掉）一定的化学基团，称为共价修饰（covalent modification ），酶被修饰后，称为共价修饰酶。共价修饰调节的类型磷酸化与脱磷酸化（最常见） 乙酰化与脱乙酰化甲基化与脱甲基化 腺苷化与脱腺苷化肌肉中磷酸化酶的磷酸化

37、和去磷酸化过程：118由激素启动磷酸化的级联机制 （二）别构酶（allosteric enzyme）概念：有些酶分子表面除了具有活性中心外，还存在被称为调节位点（或别构位点）的调节物特异结合位点，调节物结合到调节位点上引起酶的构象发生变化，导致酶的活性提高或下降，这种现象称为别（变）构效应（allosteric effect）,具有上述特点的酶称别（变）构酶（allosteric enzyme）。1.别构酶的结构部位1）活性部位：负责E对S的结合与催化；2）别构部位：可结合调节物，负责调节酶反应速度 。这两部位可在不同亚基或同一亚基不同部位上。2. 别构效应剂 (allosteric effe

38、ctor) 导致别构效应的代谢物别构激活剂（allosteric activator）-使酶活性增加的效应剂（底物）别构抑制剂（allosteric inhibitor）-使酶活性降低的效应剂（产物）别构激活剂： 正协同，加快反应速度（酶分子结合一分子底物或效应物后，酶的构象发生变化，这种新的构象有利于后续分子与酶的结合，大大促进后续分子与酶的亲合性） ，多为S曲线，如：ATP对ATCase。别构抑制剂： 负协同，减慢反应速度，多为代谢终产物。如：CTP对ATCase。3.别构酶的特点1)有多个亚基，即为四级结构；2)酶分子中除了有结合底物并催化反应的活性中心外，还有可以结合调节物的别构中心。

39、活性中心和别构中心可能位于不同的亚基或相同的亚基的不同部位。4. 别构酶的动力学及别构酶对酶反应速度的调节1)大多数别构酶具有正协同效应（酶分子结合一分子底物或效应物后，酶的构象发生变化，这种新的构象有利于后续分子与酶的结合，大大促进后续分子与酶的亲合性），其初速度与底物浓度的关系呈S形的v-S曲线 124当底物浓度发生很小的变化时，别构酶就可极大地控制着反应速度。在正协同效应中使得酶反应速度对底物浓度的变化极为敏感。2）另一类别构酶具有负协同效应，其动力学曲线在表现上与双曲线相似，但意义不同具有负协同效应的酶在底物浓度较低的范围内酶活力上升快，但再继续下去，底物浓度虽有较大的提高，但反应速度

40、升高却较小。使酶反应速度对底物浓度的变化不敏感。125大多数别构酶不符合米氏方程。1.非别构酶曲线 2.正协同别构酶 3.负协同别构酶126酶的别构（变构）效应示意图127 别构酶与别构调节128 三、多功能寡聚酶有的寡聚酶所含的亚基结构不同，每种亚基表现不同的功能，因而整个酶分子催化两个或两个以上的相关反应，这种寡聚酶称为多功能寡聚酶。大肠杆菌的色氨酸合成酶含A和B两种蛋白质，蛋白质A含有一个亚基，蛋白质B含有两个亚基。这两种蛋白质各自催化一个化学反应。 大肠杆菌色氨酸合成酶催化的化学反应吲哚甘油磷酸 ® 吲哚 3磷酸甘油醛吲哚 L-丝氨酸 ® L-色氨酸当两个A蛋白与一

41、个B蛋白结合形成、聚合体时，就构成了完整的色氨酸合成酶（以表示）。它能将上述两个反应偶联而催化总反应：吲哚甘油磷酸L-丝氨酸 ® L-色氨酸3-磷酸甘油醛四、人工酶人工合成的具有催化活性的蛋白质或多肽（一）抗 体 酶133 134过渡态类似物®¾¾免疫动物®¾¾抗体此抗体具有：1）加快反应速度：102 - 105倍； 2）具酶性质：专一性、催化活性、酶动力学行为均符合。抗体酶的研究价值 为酶的过渡态理论提供了实验证据 2.广阔的应用前景（1）按照人们的设计对特定的肽键进行水解的抗体酶，将为蛋白质结构的研究提供新的手段。（2）

42、医学。（3）制药工业 。突变酶 用基因定位突变技术修饰天然酶基因，然后用基因工程技术生产该突变基因的酶，被称为突变酶。模拟酶b-benzyme 136催化侧链连接到环糊精上，可模拟胰凝乳蛋白酶第七节 酶活力(enzyme activity)的测定一酶活力1.酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示，酶催化的反应速率愈大，酶的活力愈高；反应速率愈小，酶的活力就愈低。两者呈线性关系。所以测定酶的活力就是测定酶促反应的速率。 139酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。在实际酶活测定中一般以测定产物的增加量为准。

43、V = p / t p = v t引起酶促反应速率降低的原因(1)底物浓度的降低； (2)产物浓度增加加速了逆反应的进行；(3)产物对酶的抑制或激活作用 (4)随着时间的延长引起酶蛋白部分失活等。因此测定酶活力，应测定酶促反应的初速率，反应初速率与酶量呈线性关系，因此可以用初速率来测定制剂中酶的含量。 2酶的活力单位(U，activity unit) 酶活力单位的定义：某种酶在一定条件下，一定时间内酶作用的底物的减少量或产物的生成量。有2种表示方法：IU （常用） Kat国际酶活力单位1961年,国际生物化学协会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”(IU)来表示酶活力。规定为：在最适反应条件(

44、温度25)下，每分钟内催化1微摩尔(umo1)底物转化为产物所需的酶量,定为一个酶活力单位，即 1 IU = 1 umolmin。 1972年国际酶学委员会又推荐一种新的酶活力国际单位，即Katal(简称Kat)单位。规定为：在最适条件下，每秒钟能催化1摩尔(mo1)底物转化为产物所需的酶量，定为1Kat单位(1Kat=1mol·s1)。Kat单位与IU单位之间的换算关系如下：1 Kat = 60×106 IU 1IU = 160 Kat二酶的比活力(specific activity)比活力:每mg蛋白质所含的酶活力单位数。比活力 = 活力Umg蛋白= 总活力U/总蛋白m

45、g有时用每g酶制剂或每m1酶制剂含有多少个活力单位来表示(Ug或Uml)。比活力大小的含义：可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力。比活力愈大，表示酶的纯度愈高。三酶活力的测定方法 测定酶活力就是测定产物增加量或底物减少量，主要根据产物或底物的物理或化学特性来决定具体酶促反应的测定方法，最常用的方法介绍如下：(1) 分光光度法 (2) 荧光法 (3) 同位素测定方法 (4) 电化学法（1）分光光度法（spectrophotometry）：多利用产物在紫外或可见光部分的光吸收性质，选择适当波长，测定反应过程的进行情况。简便、节约时间和样品，可以检测微量水平的变化。（2）荧光法(fluorometry)：主要利用底物或产物的荧光性质。灵敏度高，但易受到干扰。（3）同位素测定法：同位素标记底物，反应后经分离，检测产物的脉冲数，即可换算成酶的活力单