细胞生物学实验指导书

1、细胞生物学实验指导书适用专业：生物科学、生物技术实验目录实验一 植物原生质体的分离与融合1实验二 动物细胞原代培养3实验三 细胞传代培养4实验四 植物细胞骨架的光学显微镜观察5实验五 细胞凋亡的诱导、观察与检测7实验六 环境因素诱变染色体改组的观察9实验七 红细胞膜蛋白的分离及其电泳检测11实验一 植物原生质体的分离与融合实验项目类型：综合性所属课程名称：细胞生物学实验计划学时：7学时一、实验目的 1.掌握原生质体分离的原理与技术；2.了解细胞融合的基本原理及应用；3.初步掌握PEG融合法和电融合法。二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞。原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物

2、器官（叶等）获得。但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致。原生质体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后获得。原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似。但原生质体由于除去了细胞壁，所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定。常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液 的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合。细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇（PEG）法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点

3、的膜分子发生重组，然后由于表面张力作用，形成一个球形细胞。原生质体分离融合和培养的意义：1.除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，为制造新杂种开辟了道路。植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。2.原生质体可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。三、实验

4、仪器与材料1.材料：油菜叶子、白菜花2.溶液或试剂：（1）洗涤液：甘露醇0.7mol/L，CaCl2·2H2O 3.5mmol/L, KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6)，高压灭菌；（2）混合酶液：1.5纤维素酶，1果胶酶溶于洗涤液中(pH 5.6)。（3）50%PEG（4）高pH高钙稀释液：（5）20%蔗糖溶液（6）DPD培养基：3.仪器或其他用具：超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镊子、解剖刀、剪子、 接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等。四、实验步骤(一)原生质体的制备:1取材：取新鲜油菜叶和白菜花瓣自来水洗净，再用7

5、0%乙醇浸泡30S，0.5次氯酸钠消毒10min,无菌水冲洗5次.2酶解: 材料切成1mm宽细丝,加入适量酶液,置摇床上（6070rpm），在2528黑暗条件下，酶解57h. 3分离: 用200目网过滤除去未完全消化的残渣,在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。加入3 4ml 洗涤液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液。用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20蔗糖溶液上(5ml离心管装3m1 20蔗糖溶液)，在1000rpm条件下离心510分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20的蔗糖与洗涤液之间，破碎的细胞残渣沉入管底。用200l移液器轻轻将

6、状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液)，放入另一干净的离心管中，加4ml洗涤液，1000rpm离心2-5分钟，弃上清(二)原生质体融合:1将原生质体用 DPD调节浓度为1×105个/mL。2将原生质体混合物滴入小培养皿，静置810分钟。3然后滴入50的PEG溶液，静置2分钟。4依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml高钙高pH洗涤液。注意在第二、三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡；最后用液体培养基洗l2次。制片，镜检。五、实验报告 画出观察到的融合细胞，并计算融合率。六、思考题 1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质

7、体,在实验中应注意那些问题? 增多数量的方法：多取材且尽量切碎，增加酶浓度，提高酶解温度，延长酶解时间，操作轻柔，勿使原生质体破碎等。提高生活力的方法：取新鲜材料，采用合适的酶浓度、作用温度和时间等。 2.举例说明原生质体融合的应用价值。实验二 动物细胞原代培养实验项目类型：基础性所属课程名称：细胞生物学实验计划学时：4学时一、实验目的 1.掌握动物细胞原代培养的基本方法和操作过程；2.熟悉原代培养细胞观察方法。二、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养。原代培养是建立各种细胞系的第一步，该技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究。分为组

8、织块培养法和消化法两种。三、实验仪器与材料1.材料:小鼠心、肝、脾、肾等2.溶液或试剂：（1）RPMI-1640培养基、小牛血清。（2）0.25胰蛋白酶、(pH 5.6)。（3）Hanks液3.仪器或其他用具：CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、解剖器械、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等。 四、实验步骤 1.处死小鼠:将小鼠用颈椎脱臼法处死，放入75酒精种浸泡消毒。2.取材：在超净工作台中用灭菌的解剖器械剖开小鼠腹腔，辨认并取下肝脏、脾脏和肾脏，放入灭菌的培养皿中，加入Hanks液清洗，然后加入2mL胰蛋白酶液，研磨并过滤。3.将液体转移到离心管，1200

9、rpm离心5min收集细胞，加入适量培养液，CO2培养箱培养。4.观察：逐日在倒置镜下观察细胞生长情况。五、实验报告 画出细胞贴壁前和贴壁后的形态。六、思考题 试述细胞原代培养成功的条件?实验三细胞传代培养实验项目类型：基础性所属课程名称：细胞生物学实验计划学时：3学时一、实验目的 1.熟练掌握贴壁细胞传代的培养方法；2.观察传代细胞贴壁、生长、繁殖过程中细胞形态的变化。二、实验原理离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其它比率转移，接种到另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通

10、常采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代。 三、实验仪器与材料1.材料：原代培养的小鼠细胞或Hela细胞2.溶液或试剂：（1）RPMI-1640培养基、小牛血清。（2）0.25胰蛋白酶、(pH 5.6)。（3）Hanks液3.仪器或其他用具：CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等。四、实验步骤 1将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置510分钟。2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，

11、加入35ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。3将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。五、实验报告 分别画出贴壁生长的小鼠细胞和Hela细胞,并说明二者的不同.六、思考题 写出细胞传代培养成功的条件?实验四 植物细胞骨架的光学显微镜观察实验项目类型：基础性所属课程名称：细胞生物学实验计划学时：3学时一、实验目的 了解细胞骨架的结构特征及其制备技术二、实验原理细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，

12、能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用。用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色或间接免疫荧光标记以后，可在显微镜下观察到细胞骨架结构。三、实验仪器与材料1.材料：洋葱鳞茎和口腔上皮细胞2.溶液或试剂：（1）M-缓冲液（2）6mmol/L(pH 6.8)磷酸缓冲液（3）1Triton X-100（用M-缓冲液配制）（4）0.2考马斯亮蓝R250（5）3戊二醛3. 仪器或其他用具：光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子、小剪刀

13、、吸水纸、擦镜纸等。 四、实验步骤 1.撕取洋葱鳞叶内表皮若干片，大小约1cm2，置于青霉素小瓶或小烧杯中。2.用磷酸缓冲液（PBS）浸泡片刻。3.吸去磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20分钟。抽提细胞骨架以外的蛋白质，从而使骨架图像更加清晰。4.吸去TritonX-100，用M-缓冲液洗3次，每次3分钟。M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用。5.用3%戊二醛固定15-20分钟6.用PBS洗3次，每次3分钟7.考马斯亮蓝染色15分钟8.蒸馏水洗2次9.置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察。五、实验报告 绘出植物细胞骨架微丝结构图。六、思考题 说出各步骤的目的和一些重要试剂的在此

14、处的作用。实验五 细胞凋亡的诱导、观察与检测实验项目类型：创新设计性实验所属课程名称：细胞生物学实验计划学时：9学时一、实验目的 1.了解细胞凋亡的概念和原理；2.掌握细胞凋亡诱导的方法；3.认识细胞凋亡的特征。二、实验原理人体内的细胞注定是要死亡的，目前人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡。坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。凋亡是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为。其细胞及组织的变化与坏死明显不同。细胞凋亡的形态学变化：首先

15、细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后胞质密度增加，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解，胞膜形成小泡，最终为为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。凋亡细胞DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死呈弥漫的连续图谱。三、实验仪器与材料1.鸡血细胞2.溶液或试剂：生理盐水，20mmol/LCaCl2 顺铂，姬姆萨染色剂， Tris.HCl,SDS, EDTA, 乙醇，甲醇，蛋白酶K。3.仪器或其他用具：超净工作台

16、、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镊子、解剖刀、剪子、 接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等。四、实验步骤 (一)细胞凋亡的诱导：1.采鸡血10ml，加0.85%的生理盐水混匀，1200r/min离心5min，弃上清液（重复三次），制备红细胞悬液，然后加入50ml血细胞保存液混匀放于4冰箱中备用。.取4个试管，各加入鸡血细胞保存液2ml，在1号管中加入2ml 生理盐水作为阴性对照，2号试管加入2ml 10ug/ml的顺铂溶液作为阳性对照；3号试管中加入2ml 20mmol/L的CaCl2溶液进行胁迫处理；4号试管不加任何物质，实验时煮沸5 min 使细胞坏

17、死。（二）细胞凋亡的形态学观察：1处理4h 取样，用生理盐水稀释5倍，各取50ul细胞悬液均匀涂布于5片载玻片上，晾干。2用甲醇固定2min，然后在载玻片上滴加适量姬姆萨染液染色10min。3用蒸馏水轻轻洗去染液，室温晾干，在光学显微镜下观察细胞形态变化。4照相，并对试验组细胞进行凋亡计数统计。（三）DNA 梯状条带的检测：1离心收集鸡血细胞，弃上清。2加入1ml的细胞裂解缓冲液重悬，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20l，混匀。3在65恒温水浴锅中水浴30min（也可转入37水浴1224h），间歇振荡离心管数次。4于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上

18、清液入另一离心管中。5加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，或12,000转/分离心5分钟,弃上清,晾干6用50ulTE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，并加入RNase A(10ug/ul)5ul，于37保温1015分钟。71.2 %琼脂糖凝胶，75 V电压，电泳45 min 左右，8紫外灯下观察并照相。（琼脂糖凝胶电泳：称取1.2克琼脂糖加入100ml 1×TBE),加热使之溶解,取一个凝胶模子,两端用胶布封好,水平放置.将制孔器(即梳子)放在模子一侧约0.5cm处,其底部距模子约1mm.待琼脂冷至约70时,加入10ul 0.5mg/ml EB,混匀,

19、倒入模子,待冷却凝固后,取下梳子,撕去两端胶布,放入电泳槽中,使有加样孔的一端放在负极一端.在电泳槽中加入1×TBE至超过凝胶表面约1mm. 加入DNA电泳样：1.5ul DNA (DNA ladder)+3.5ul ddH2O+1ul buffer。打开电源,使电压为10V/cm凝胶.当溴酚蓝走到凝胶的3/4处,停止电泳.紫外灯下检测电泳的情况。）五、实验报告 画出凋亡细胞与坏死的形态。六、思考题 列举3种以上检测细胞凋亡的方法。实验六环境因素诱变染色体改组的观察实验项目类型：设计性所属课程名称：细胞生物学实验计划学时：7学时一、实验目的 1学会鉴别外界条件诱变染色体改组的各种类型

20、，为进行环境监测和诱变育种提供细胞学方面的依据。2使大家认识到生活中的各种有害因素，提高自我保护和环保意识。二、实验原理目前，由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排放等都存在污染环境的可能。欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，就需要一套高度灵敏，技术简单易行的系统来监测环境的变化。而生物监测技术是目前进行环境污染，化学诱变物质以及辐射对机体损伤程度监测的一个主要指标。同时，它也为进行辐射防护、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面提供了很好的手段。 用于进行环境因素、诱变物质、辐射损伤的生物检测方法包括染色体畸变类型的检测和微核的检测等

21、。常用于测试的材料有鸭跖草、水葱花、韭菜花等的花穗，以及蚕豆根尖和小白鼠等。一般来说，处于分裂过程的细胞，对环境因素最敏感，尤其是处于减数分裂时期的花粉母细胞。诱变物质、环境污染及辐射对人类和其它高等生物的遗传损伤，在细胞水平表现为染色体畸变，遗传损伤不仅表现在体细胞，而且也通过生殖细胞扩散和积累。三、实验仪器与材料1.材料：大葱花或大葱根尖2.溶液或试剂：（1）无水乙醇（2）盐酸（3）甲醇（4）冰醋酸（5）改良苯酚品红染色液3.仪器或其他用具：显微镜、解剖针、酒精灯、载玻片、盖玻片、吸水纸等。 四、实验步骤 1取材：选取处于减数分裂期的花穗剪下15-20cm的花序，或取旺盛分裂的根尖，部分插

22、在自来水中作对照，另一部分插在污水中，处理1224h，再移到自来水中恢复培养24h。2固定：用卡诺氏固定液固定12h，经95%、85%乙醇各30min，70%乙醇4保存。3制片：剥取花药，用镊子轻轻捣碎，或将根尖酸解10分钟后压片，用改良苯酚品红染色510min ，去掉残渣，盖上盖玻片。4镜检：用低倍镜找到分裂期细胞，再转用高倍镜，可看到经污水处理过的细胞中，染色体畸变的类型和微核的数目，分别要比对照组高。微核出现的多少，可作为监测环境污染程度的指标。五、实验报告 画出观察到的微核和染色体畸变类型并计算染色体畸变率。六、思考题 列举生活环境中可以导致染色体畸变的因素.实验七、膜蛋白质的分离与鉴

23、定实验项目类型：综合性所属课程名称：细胞生物学实验计划学时：8学时实验目的1掌握血影膜的制备及膜蛋白质的电泳分离技术。2了解以上实验技术的原理和意义。实验用品一、仪器超速离心机、平板式电泳架电泳仪移液器离心管注射器、长针头注射器(50m1)、水浴锅、微量注射器(100l)、parafilm 纸封、各类吸管、量筒、烧杯等。二、试剂及样品备制1PBS(phosphafe buHer saline)5 mmolL Na2HP04 (Mw142)5 mmo1L NaH2P04 (Mw=140)145 mmo1L NaCl (Mw=58.5)pH7.62磷酸盐缓冲液(pH7.6)Na2HpO4 5 mm

24、o1LNaH2P04 5mmo1L3.solution A (Acrylamide Stock Solution),100ml30%(w/v) acrylamide,0.8%(w/v) bis-acrylamideCaution: Unpolymerized acrylamide is a skin irritant and a neurotoxin.Always handle with gloves.See Safety Notes.a.29.2g acrylamideb.0.8g bis-acrylamideAdd distilled water to make 100ml and sti

25、r until completely dissolved .Work under hood and keep acrylamide solution covered with Parafilm until acrylamide powder is completely dissolved.Can be stored for months in the refrigerator.4.Solution B (4× Separating Gel Buffer),100mla.75ml 2M Tris-HCL (pH8.8) 1.5Mb.4ml 10%SDS 0.4%c.46ml H2OSt

26、able for month in the refrigerator.5.Solution C(4× Separating Gel Buffer),100mla.50ml 1M Tris-HCL(Ph 6.8) 0.5Mb.4ml 10% SDS 0.4%c.46ml H2OStable for months in the refrigerator.6.10% ammonium persulfate ,5mla.0.5g ammonium persulfateb.5ml H2OStable for months in a capped tube in the refrigerator

27、.7.Electrophoresis Buffer ,1 liter (2L)a.3g Tris 25mMb.14.4g glycine 192Mmc.1g SDS 0.1%d.H2O to make 1 LpH should be approximately 8.3.Can also make a 10× stock solution.Stable indefinitely at room temperature.8.5× Sample Buffer ,10mla.o.6ml 1M Tris-HCL(pH6.8) 60mMb.5ml 50% glycerol 25%c.2

28、ml 10% SDS 2%d.0.5ml 2-mercaptoethanol 14.4mMe.1ml 1% bromophenol blue 0.1%f.0.9ml H2OStable for weeks in the refrigerator or for months at -20.9.Calculation for X% Separating GelSolution A x/3mlSolutionB 2.5mlH2O (7.5-x/3)ml10% Ammonium Persulfate 50ulTEMED 5ul(10ul if x<8%)Total Volume 10ml10.E

29、xample of Stacking Gel PreparationTwo 5% Stacking Gels(6×8cm×0.75mm),4ml2.3mlH2O0.67ml Solution A1.Oml Solution C 30ul 10% Ammonium Persulfate5ul TEMED11染色液0.04 Comassie brilliant blue R25010HAC25Isopropl alcohol12脱色液7.5 HAC5 MeOH实验方法一、血影膜制备方法实验步骤：1取全血5ml 置入离心管中；2加入1ml的磷酸盐缓冲液(PBS)，再以1 000r

30、min 离心5min，温度为4；3离心后呈现图左所示：弃去上清液和中间的一层淡黄色帽状物(bully coat)，在上清液中主要包括血清和PBS 成份，帽状物中包括白细胞和血小板等，只留下最下层的压积的红细胞(packed RBC)；4再重复以上l2 次，洗涤被压积的红细胞；5洗涤后，去上清液，只留下被浓缩的RBC 部份；6加入15(20 倍的的磷酸盐缓冲液，并将其与RBC 混合均匀，在常温下(20)静置 2025min 进行低渗处理，然后置入高速离心机内(4)以10 00015 000rmin 离心1520min。7离心后呈图左所示:弃上清液和最下层的一块粉红色纽状沉淀，这时在上清液中主要包

31、括PBS 和血红蛋白，在最下层的钮扣状沉淀中含有大量的蛋白酶，要清除干净，否则会影响以后的电泳结果，只留下中间的一层血影膜。8将团块状的沉淀，重复(按6)洗涤12 次，直至血影膜呈乳白色，去上清液后，即为所制备的样品。二、样品的电泳分离1制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶（1）配制9%分离胶（15ml）：双蒸水6.55ml，1.5M Tris-HCl（pH8.8）3.75ml，30%丙烯酰胺储存液（Acry/Bis）4.5ml，10%SDS 150ml，10%过硫酸铵（APS）50ml，混匀后加入3.75ml TEMED，立即混匀，灌入装好的垂直板中，至距离短玻璃顶端约2cm处。检查是否有气泡，如果有

32、，用滤纸条吸出。在胶液上面加一层双蒸水，静置，待凝胶与水的界面清晰时，说明分离胶已聚合（约30分钟），去除水相，用滤纸吸干残存的液体。（2）配制4%浓缩胶（10ml）：双蒸水6.1ml，0.5M Tris-HCl（pH6.8）2.5ml，30%丙烯酰胺储存液（Acry/Bis）1.3ml，10%SDS 100ml，10%过硫酸铵（APS）50ml，混匀后加入10ml TEMED，立即混匀，灌入垂直板中至短玻璃顶端，插入梳子，避免产生气泡，静置，约60分钟后，胶聚合，拔去梳子，用电极缓冲液冲洗加样孔，以去除未聚合的丙烯酰胺。（3）将凝胶固定在电泳槽中，上下槽各加入1´Tris-甘氨酸电泳缓冲液，驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡。样品处理及上样：在Ependorf管中加入蛋白提取液16ml，5×上样缓冲液4ml，充分混匀，与蛋白分子量标准一起放在100°C沸水中煮5分钟后，用微量加样器上样。为了便于比较蛋白电泳结果和免疫印迹结果，采取对称加样。将电泳装置接通电源。开始电泳时，电压为80V，当样品进入分离胶后，将电压调到150V。继续电泳至样品前沿抵达分离胶底部，断开电源。采用平板电泳，将胶用注射器注入电泳管或平板腔内，使胶液高度为110