欧洲药典附录2612非无菌产品的微生物限度检查之一有活力的需氧菌总数的计数

1、DrHfbina 2003.wol4 Nq4中药品标斥2003年第4吞第4期3?分国外药品标准侑息译看按：仍典（PharnuspoJO是一*国駆记仪药品规格、标加的法典.大多微由国求级仅药典吳貝僉編印，并由政府颁市具有水 律的釣束力.药典中规定了常用为轨及侶剂的枚量标准并将各神绘交的具体方法玫入阳录药典展一定柱度上可反咬 MBJ家药场生产氐疗舸科技的水丰.Q HT.tti中28加入WTO俎饮，純品的廉护及$种仃刑的进出口檢瞼極*及方法均t 要兴黑进、出口口的药典网时，在遥口药昂注册及进口药呢用HJl核时.相应的送审責料中均妥歩药吕廣*标准的栓脸标鼻 及其中译本并且奏求，各奂中丈译件必须屯实原丈

2、并打合中刃的专业規范.引用聂參的紋是药典的附聂部分内*。本尢 将耿洲芳典阳录中的非无苜户品的微生物限度检交章节译出希艺能龄医药界工作者提供*考.欧洲药典附录2612非无菌产品的微生物限度检查之一（有活力的需氧菌总数的计数）张新妹&坍畐勤译 王淑兰审校万方数据万方数据下述检验方法是对需義条件下生长的嗜温细菌 和真螯数的计数检査。这些试验设计主要用来检査样品是否符合药典 对徽生物限度的要求，用于这一目的时要遵守以F 指导原则，包括样品的抽样数选取及结果的解释。这 些试验也可以用于药典中抗菌防属刑效力的检验。 它们可进一步用来监测原料质量，药物制刑的微生 物质监测等。当用于这些目的时，例如生

3、产者用于 原料和/或成品的检测或者用于认证过程评价时在 生产者和主管当局间协商一致，包括抽取样品数及 结果的解释是至关重要的.检定应该在样品不会被污染的条件下进行.用 来防止污染的预防措施必须不影响崔试验中徹生物 的检出。如果被检测的产品含有抗菌活性，它必须被 充分中和，并证明所用的火活刑是有效的和对1ft生 物迪无竜性的本章描述了薄膜滤过法,培养板记数袪测定有 活力的需氣菌总数"当没有其它方法进行细菌计数时可用最大可能 数法。方法的选择基于产品的性质及预期的徹生物 数董这些因素。任何被选用的方法必須被适当地验 证。当5.1.3章或5.1.4章联合应用时，可以使用 完全平皿法（pou

4、r-plate）.表面涂布平皿计数法 （surface-spread）及薄 0| 滤过法。供试品的准瞥抽验方法:必须遵循已经局密规划的抽验方法。 中*跖£生笥剖E检定所忱生索室北京100050 中SB药品生制品检定序所办 北» 1Q0050该抽验方袪由这些因索而定：一批样品的数虽，与不 被接受的高污染产品相关的健康危险产品的特廿, 污染的预期水平等.除另有规定外取10g或10ml 样品或制剂按上述方法预处理从原料中或从制剂 包装中随机地选取样品.根据样品（原料或制剂的 待性,必要时可从多个包装中取样混合后，得到丿听 需检品量，是否适用于样品的抽样方法的关键是样品均- 性因为

5、样品的均一性关系到微生物的分布，被认町 的三个抽样种类是：（1）可接受的样品，例如；每克或毎毫升仅含心 于m个菌落形成单位的样品。在这里m是相关章ft' 中的规定限度。（2边躱样品，例如：每克或每毫升所含菌落形 成单位多t m个少于十倍m个的样品.（3）缺陷样品，例如：每克或每奄升所含苗落形 成单位超过十倍m个的样品。水溶性产品取10克（或10毫升）样品溶解或稀释到pH - 7,0的氯化钠-聂白腺缓冲液（或另一种可获得的 液体）中通常预先准备】« 10的稀释液，然而，由于 产品的特性及所需要的灵敏度不同，也有可能稀释 成其他的比例如果该产品含有抗斎活性物质应衣 稀释液中加人灭

6、沽剂，如果需要，调节pH值到7左 右,用相同的稀释剂做进一步的10倍稀释.不溶于水的非庸涪性产品取10克（或10亳升）样品悬浮到pH=70的 氯化柄一蛋白陈缓冲液（或另一种液体）中"通常笊 先准备1 ： 10的悬浮液，由于产品特点，也可能要进万方数据万方数据Dru* 气wrkrd、cChin.扌03"H 4 塁儿 C6（于tU为阳标莎23年探U金第4期（总252；培养基的有效性和计数方法的正确性側试细菌分别用合适的液体培养基（如肉汤培养基A）在3035C培养18小时到24小时；测试真菌分别用伶活的液体琼脂培养基（如不含抗菌物质的培养基C）在2025f培养白（下转17页万方数

7、据-步梅释“ -种适用的表面活性JW例如，加入lg/L 的集山梨酸苗80有助于湿润性枝差的物质的悬浮 分散如果该产品含有抗茵活性物质可在稀释液中 加入火沽剂。如果襦要凋节pH值到7左右，并且 用相同的稀释剂做进一步的】。倍稀释。脂溶性产品取样品10克（或10亳升）加无菌聚山梨酸酯 80或其它适宜的表面活性剂（不超过样屈质就 半混合均匀该表面活性剂起匀化检品的作用.如 需要，可加热但不允许超过40-Co待殊情况下，某些 产品可能需在尽可能最短的时间内加热到不高T 45 C.小心混合,需要时在水浴或培养箱内保持这 个温度。加人预热的pH = 70的氯化钠一蛋白豚缓 冲液使其成为1 : 10供试品液

8、。在小心混合的同时， 保持温度不超过30分钟，以便形成乳状液°如需要 做进步的十倍禅释.町用pH-7. 0的氯化钠-蛋 白脓缓冲液（含一定比例无菌聚山梨酸酣80或适宜 的表面沽性剂逬行稀释。透皮吸收剂取已用无SiST除去“释放衬垫”的本品十贴， 将具有粘性的一面朝上置无菌玻璃或级*1盘内，用 无菌的医用纱布（或起滤过作用的单纤维聚合体的 畅辂）厦蛊在粘性面上如需要转移10贴贴剂到最 小500ml体积的pH = 7o的氯化钠一蛋白腌缓冲 液，缓冲液中含适当的灭活刑或钝化刑，如无菌聚 山梨酸酯80和/'或卵澎脂。剧烈撮摇该制剂至少30 分钟（制剂A）,同法制备另外10贴放蛙在至少

9、 500ml肉汤培养基D中，剧烈振摇该制剂至少30分 钟（制剂B 供试品钠检査 膜过滤使用孔径不大于0.45pm,具戡留细菌效力的 滤职L该滤簇的材料选择能使细菌有效截留而不影 响供试品的检验°例如，硝駿纤维素滤器用于水溶 液，油状和乙醇的榨溶液醋酸纤维素滤器用于乙醇 的浓溶液。过滤脣具应设汁为滤簇可取下转移到培 养基中.参照供试品制备一节，转移一定数就（含1克供 试品的数撤如估计样品含有大就曲摘形成单位数. 则可适当减少J供试品的稀释液到两联滤器中的 一个，立即过滤。相继用每次约100ml的合适液体 如pH=70的氯化钠蛋白廉缓冲液，冲洗每张滤 膜三次可以加人表面活性剂如聚山梨酸f

10、ifi 80或针 对抗菌物质的灭活剂。如经论证，则冲洗不应超过三 次。将主要准备作细菌计数的其中一联滤器的谑骐 转移到一种琼脂培养茎表面，如：培养基3或者其 他的；准备作真苗计数的其中一联滤器的滤膜转移 到一种琼脂培养旱表面，如;培养基C.如希望在较短时间内得到可靠的计数，检圜细 茵的平血（装有培养基B的平皿）在3035 C培养5 天，检側直菌的平皿（装有培养基C的平皿）在20 25'C培养5天。送禅小于100个歯落形成单位的有最高生长菌 蒋数的平皿进行计数。并且计算每克或每毫升供试 品所含的菌落形成单位数。透皮吸收剂检验时，制备A的滤液50ml.应分 别用两张滤膜过淀一张滤膜覽琼脂培

11、养基B上培 养，计算需緘微生物总数；另一张滤殒眸琼脂培养基 C上培养，计WAM总数.平II计斂方法a. 完全平ffll法（Pour-Plate method）在宜径9ctn的陪替氏半皿中，毎皿加入bnl经 预处理的受检制品和约1520mi的液化琼脂培养 基，此种培养基适台细菌生长（如培养基B儿或5 20ml适合真歯生长的液化琼脂培养基，（如培养 基C）.液化培养基的湿度不超过40Vo如果用较大 的陪替氏平1«1,琼脂培养基的数量相应蹲加稀释水 平相同的培养基要准备2只同样的陪普氏平恻耍在较短的时间内得到可靠的计数，将准备检 测细菌的培养血（装有培养基B的平皿）在30 35C培养5天K

12、菌的培养皿（装有培养基C的乎 皿在2025C填养5天。菌落计数。根据稀释度来选择用来计数的平皿. 在该稀释度的平皿中细菌的菌落形成单位最多不超 过300个（页菌的茵疼形成单位最多不超过100）。 取同一稀释度两个平皿菌落形成单位的算术平均 值,用来计算每克或每毫升样品所含的菌数。b. 表面涂布平El计数法Surface-spread method）在直径9cm的殆替氏平皿中.每皿加入约厅 20ml fc45r左右的适合细菌生长的臧化琼脂培养恵 （如培养墓B）。或加人1520ml、45C左右的适合 于真菌的生长液化的琼脂培养基（如培养星C>,固 化平皿内的培养基如果用较大的陪昏氏平皿，琼脂

13、 培养基的数址相应地增加。在培躱箱或1.A卜工朱台 上干燥碟子在而化培养基表面涂布一定总（不少于 0. lml）的经过预处理的检品。毎一稀释水平相同培 养基需姿准备2只同样的陪檸氏平皿.Dwg Sundtnd、£ Cbin. 20*?38 4 No* >培养片法及菌落形成单位计数方法均参照完全 平皿法（Pour Plate method）量大可能数法（Mo戏Probable Number）最大可能数（MPN法的准礎度和精密度都小 于薄膜计数法和平皿计数法，待别在真菌计数结果 不可靠由尸以上原因，在没有其它合适方法的情况 下，才用于细菌计数如果该方法经过验证可以应 用，同时按以下

14、燥作进行；准备系列（至少三个）连续的1 : 10稀释度的 样晶每-个连续稀释度均1克或1垂升接种到装 有9毫升适合的液体培养基（如肉汤培养基A）的试中担妗E标虐 乃03年餉4住* 4期（4号3>豹 管中，使之成为10毫升。如有需要，一种表面活性剂 例如聚山梨酸酣80或针对抗菌物质的灭活刑可以 被加入到培养基中。因此三个稀释度共接种9支试 管。接种管在3035C培养5天，记录每-稀释反 有傲生物生长的管子的数目由于样品的特性造城 的读取结果困难或不确定可再次用相同的培养基 传代培养,或用另外一种适宜琼脂培养基（如琼脂培 养基B）在相同温度下培养18小时到24小时并且 以这次结果为准。査阅表

15、2612 I获得样品每克或每底升所含细菌的堆大可能数.类别】：正常的结果95%的情况下得到此种结培养基的有效性和计数方法的正确性側试细菌分别用合适的液体培养基（如肉汤培养基A）在3035C培养18小时到24小时；测试真菌分别用伶活的液体琼脂培养基（如不含抗菌物质的培养基C）在2025f培养白（下转17页万方数据培养基的有效性和计数方法的正确性側试细菌分别用合适的液体培养基（如肉汤培养基A）在3035C培养18小时到24小时；测试真菌分别用伶活的液体琼脂培养基（如不含抗菌物质的培养基C）在2025f培养白（下转17页万方数据哀2 6. 12-1 如甫的聂大可能数评价毎一聲释度各三背阳性管散目类别

16、95%就傅区间01克0. 01 克0. 001 克大可能败1J00<3103X<1171003X!21017X227107X2-2812011X4359009X23820114X54821015X55021120X86122021XR6330023X71293°138X1018031043X2021031175X2028032093X30390321150X50510322210X80640330240X1001400331460X-20024003321100X3004800333>1100»果。类别2：可能性很小的结果。仅有4%的悄况下 得到此种结果。

17、在重婆的决定中，此结果不被采用。 结異出现的可能性小于种类2的倩况礼有列出并 且也不被接受。Drug StEbrd，of China 4 Ns 4中国月阳你准223甲第4鲁第4期（总？加）对消旋山罠蓉碱片含:»均匀度及含测定方法的商榷潘海建C河北省庖州市角品检验所 沧州o61001)Discussion on Content Uniformity and Assay Tests for Anisodamine Hydrochloride TabletsPan Haixia(Ca/3zA/Mr lnuitule fur Drug Cwtroi.Ccuigzhi/u.Hebei prov

18、ince 061001)培养基的有效性和计数方法的正确性側试细菌分别用合适的液体培养基（如肉汤培养基A）在3035C培养18小时到24小时；测试真菌分别用伶活的液体琼脂培养基（如不含抗菌物质的培养基C）在2025f培养白（下转17页万方数据培养基的有效性和计数方法的正确性側试细菌分别用合适的液体培养基（如肉汤培养基A）在3035C培养18小时到24小时；测试真菌分别用伶活的液体琼脂培养基（如不含抗菌物质的培养基C）在2025f培养白（下转17页万方数据中国药典2000年版二部详细规定了消旋山義 蓉碱片的含*均匀度和含敌测定方法.在实际检验工 作中笔者发现，本标准不太严密，提出两点以供商榷：1.

19、 含量均匀度检査项下“加甲基红一澳甲酚绿 （1 : 3）混合指示液5滴”.但甲基红溶液与漠甲酚绿 溶液的浓度并未指明。若按照中国药典2000年版 二部附录XV E指示剂与指示液中“甲基红一混甲 酣绿混合指示液”的方法“取0.1%甲基红的乙醇溶 液20ml,加0.2%渎甲酚绿的乙醇溶液30ml,摇勻， 即得。”配制，二者的混合比例为2，3,与标准中的1 » 3不符且二者的浓度与含量测定项也不一致.2. 含量测定项下“加0.2%甲基红与0.1%渓 甲酚绿（1 « 3）混合指示液5滴”，根据凡例二十中的 （6）灰“溶液未指明用何种溶剂时，均系指水溶液”, 而附漾XVA试药中甲基红

20、的性状为“本品为紫红 色结晶。在乙醇或醋酸中溶解，在水中不溶。”揍甲酚 绿的性状为“本品为淡黃色或棕色粉末。在乙醇或稀 緘溶液中溶解，在水中不溶为此，笔者认为该标准应作适当修改。根据含量 测定方法与试样溶解时所用的溶剂，为了达到统-, 建议将含量均匀度检査项中的“加甲基红一澳甲酚绿 （1 « 3）混合指示液5滴”与含It测定项中的“加 02%甲基红与0.1%澳甲酚绿（1 ： 3混合指示液5 満”均修改为“加0. 2%甲基红的乙醇溶液与01%漠 甲酚绿的乙醇溶戒（1 « 3混合指示液5滴”,力求使 我们的药品标准能日臻完善，有利于药品监督管理.培养基的有效性和计数方法的正确性

21、側试细菌分别用合适的液体培养基（如肉汤培养基A）在3035C培养18小时到24小时；测试真菌分别用伶活的液体琼脂培养基（如不含抗菌物质的培养基C）在2025f培养白（下转17页万方数据培养基的有效性和计数方法的正确性側试细菌分别用合适的液体培养基（如肉汤培养基A）在3035C培养18小时到24小时；测试真菌分别用伶活的液体琼脂培养基（如不含抗菌物质的培养基C）在2025f培养白（下转17页万方数据（上接61页色念珠菊培养48小时，黑曲籌培养7天金黄色酿脓葡萄球菌 如ATCC6538 （NCIMB9518,C-IP 4. 83)大肠杆苗女口 ATCC8739 (NCIMB 8545,CIP53

22、126)枯草杆荫如 ATCC6633 (NCIMB 8Ub4,CIP52. 62白色念珠菌如 ATCC10231 (NCPF 3179, IP4& 72)黑曲霉如 ATCC16404 (IMI 149007.1P1431.83)用pH = 70的氯化钠一蛋白豚缓冲液稀释每 -种培养物若干份，使试验悬浮液毎毫升含有活力 的徽生物约100个菌落计数单位。在加和不加供试 品的情况下，分别用每一种微生物的悬浮液作为计 数方法的对照组。当检査方法是膜过滤法或是平板 计数法时，任何试验微生物的计数与接种物计算值 的差异不应超过5借.当检査方迭是最大可能数法 （MPN）时，任何试验微生物的计数与接种物计算值 应在95%的置信区间内用无菌的pH = 7.0的氯化 创蛋白豚缓冲液作为试验制品进行需氧菌的计 数，来检査培养基和稀释剂是否无菌和是否无菌操培养基的有效性和计数方法的正确性側试细菌分别用合适的液体培养基（如肉汤培养基A）在3035C培养18小时到24小时；测试真菌分别用伶活的液体琼脂培养基（如不含抗菌物质的培养基C）在2025f培养白（下转17页万方数据培养基的有效性和计数方法的正确性側试细菌分别用合适的液体培养基（如肉汤培养基A）在3035C培养18小时到24小时