大鲵皮肤分泌液中抗菌肽的鉴定及生物活性研究

1、中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics201年第32卷第4期269大鲤皮肤分泌液中抗菌肽的鉴定及生物活性研究111,2王利锋，李学英，王大忠(1.遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室，贵州遵义563003;2.铜仁学院，贵州铜仁554300)摘50、G-要：目的鉴定大鲤皮肤分泌液中抗菌肽，研究其部分生物活性。方法5%醋酸浸提和SephadexG-25凝胶过滤色谱等方法分离纯化抗菌肽；采用抑菌圈法检测抗菌活性，Tricine-SDS-PAGE电泳和等电聚焦电泳鉴定其抗菌活性成份。结果大鲤皮肤分泌液中含有抗菌活性物质。对革兰阴性菌、革兰阳性菌

2、和真菌均具有较强具有较强的碱性。结论首次从大鲤皮肤分泌的抗菌活性；电泳检测显示该小分子多肽相对分子质量约为4300,液中分离纯化到一种抗菌肽，此抗菌肽可能是一个具有较强阳离子特征的碱性肽。关键词：大鲤；皮肤；抗菌肽；分离纯化中图分类号：R282.74;R961文献标识码：A1678(2011)04-0269-04文章编号：1005-CharacterizationandbioactivityofantimicrobialpeptidesfromtheskinsecretionsoftheAndriasdavidianus2WANGLi-feng1,LIXue-ying1,WANGDa-zhon

3、g1,(1.DepartmentofCellBiologyandGenetics,ZunyiMedicalCollge,Zunyi563003,China；2.TongrenUniversity,Tongren554300,China)Abstract:PurposeTocharacterizetheantimicrobialpeptidesfromtheskinsecretionsoftheAndriasdavidianusandtostudyitsbioactivity.MethodsThisantimicrobialpeptidewaspurifiedby5%aceticacidextr

4、actionandSephadexG-50G-25gelfiltrationchromatography.Theantimicrobialabilitywaschar-acterizedbyinhibitingzonedetermination.Theantimicrobialactivesubstancewasidentifiedbytricine-SDS-PAGEelectrophoresisandisoelectricfocusing(IEF)electrophoresisResultsTheskinsecretionsofnegativeGram-posi-theAndriasdavi

5、dianuscontainantibioticactivesubstanceItstronglyinhibitedGram-tivebacteriaandfungusTheelectrophoresisresultsshowedthatitsmolecularweightwasabout4300withastrongalkalineproperty.ConclusionAnantibacterialpeptidewasisolatedfromtheskinsecretionsoftheAndriasdavidianusforthefirsttimeandthisantimicrobialpep

6、tidemaybeastrongfeatureofthebasicpeptidecationKeywords:Andriasdavidianus；skin；antimicrobialpeptide;purification两栖类皮肤湿润、裸露，无疑给外界微生物的侵入提供了便利条件，为了自身生存和适应栖息地多样化生态环境的需要，它们依靠皮肤腺体分泌出一1系列抗菌肽，防御外界病原菌的侵袭。相关研究结果显示，两栖类皮肤抗菌肽呈现出超乎想象的分05-20收稿日期：2010-基金项目：贵州省教育厅自然科学研究重点项目（黔教科2007039）;贵州省高层次人才科研条件特助经费（TZJF-2007049）E

7、-作者简介：王利锋，男，硕士研究生，主要从事生物制药研究，mail:24102989；王大忠，男，通信作者，博士，教授；李学英，女，通信作者，教授。子和功能的多样性2-30国内外对于两栖类皮肤抗菌肽的研究主要集中在无尾目两栖类，例如最广泛它们皮肤抗菌肽在种类和数分布的蛙科（Ranidae）,4量等方面，都是极其惊人的。而对于有尾目两栖类，除红噱疣嫄（Tylototritonverrucosus）和山溪6目前尚未见文献报道其皮鲤（Batrachuperus外，肤分泌液存在抗菌活性物质。大鲤（MegalobatrachusjaponicusdaridianusBlan-chard属大型两栖纲有尾目

8、隐鲤鲤科，是我国二级保护动物，有活化石之称。人们在欧洲、东亚和北美地区发现的大约距今300万至7000万年的大鲤化270中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics201年第32卷第4期7石暗示其在地球上曾广泛分布。目前我国大鲤的人工养殖已经实现产业化，为从大鲤皮肤分泌液中提取抗菌肽提供了丰富的资源。作为现存个体最大的两栖类动物，其皮肤腺发达，在试验中观察到大鲤皮肤在受到理化刺激时能分泌大量白色状黏液，最初呈白浆状，后渐变为黏稠具浓涩气味。本实验对大鲤皮肤分泌液中胶状物，是否含有抗菌活性物质进行了检测，并鉴定其部分性质，为进一步的研究工作奠定

9、基础。1材料1.1动物和菌种成年大鲤雌雄各一尾，购于贵州锦江娃娃鱼有限公司。菌种：大肠埃希菌(Escherichiacoli)No.ATCC25922、金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureuSNo.ATCC29213、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermi-di§No.ATCC35984、铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginoSaNo.ATCC27853、白色念珠菌(canidiaAlbicans)No.ATCC10213、溶血性链球菌(Hemolyticstreptococcus)No.CMCC(B)32264,遵义医学院微生物学教

10、研室保藏。1.2试剂50和SephadexG-25GE葡聚糖凝胶SephadexG-Healthcar必司；低相对分子质量(Mr)标准蛋白，北Tris、京经科宏达生物技术有限公司；TEMED、Tricine、250,丙烯酰胺、过硫酸钱、考马斯亮蓝R-美国Sigma公司；BCA法蛋白定量试剂盒，上海碧云大MH(A)培养基，北京奥生物公司；营养肉汤培养基、博星生物技术有限责任公司。2方法2.1皮肤分泌液的粗提采用电刺激法诱导大鲤皮肤分泌黏液。按体积4c比1：1将收集到的皮肤分泌液用5%乙酸浸提，下搅拌24h。12000r/min离心30min取上清，用12000r/min离心30磷酸盐缓冲液调pH

11、至7.2,min,取上清冷冻干燥，2.2抗菌肽分离纯化粗提物用注射用水溶解，截留Mr10000的超滤收集Mr大于10000和小于膜4c下超滤分离，710000两部分溶液，抑菌圈法筛选有抗菌活性的SephadexG-50®胶色经0.45膜过滤后，溶液，管，测定A280nm,绘制洗脱曲线，收集各峰。同样方法筛选具有较强抗菌活性的峰，冷冻干燥浓缩样品至4.5mL,25凝胶再采用相同方法，进行SephadexG色谱(1.6cnriX60cm)分离，得到具有抗菌活性的溶液浓缩后4c保存。2.3蛋白质含量检测BCA法蛋白定量试剂盒检测抗菌肽溶液的蛋白质含量，按试剂盒说明书操作。2.4电泳鉴定2.

12、4.1Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分离胶、夹层10%和4%的丙烯酰胺凝胶、浓缩胶分别为16.5%,3种胶长度比例为4：1.5：1,胶，厚度为0.75mm,阳极缓冲液为0.2mol/LTris缓冲液(pH8.9),阴极缓冲液为0.1mol/LTris(内含0.1mol/LTricine,0.1%SDS,pH8.25)溶液。每孔上样量15pL30V恒压电泳约30min,当样品进入分离胶时，电压升至100V约3h。2.4,2等电聚焦电泳按中国药典三部(2005版)方法进行，不同之处在于配制凝胶时加入尿素，使最终的电泳胶含33%的尿素。抗菌活性检测大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜

13、2.5绿假单胞菌培养基为MH(A)培养基；溶血性链球菌的培养基为在MH(A)培养基中加入10%的脱纤维羊血；白色念珠菌培养基为沙氏葡萄糖蛋白陈琼中央孔加入注射脂培养基(SDA)o采用抑菌圈法，用水作为阴性对照，其中一孔加入相应抗生素为阳37。叵温培养18h(白色念珠菌28c恒温性对照，培养2d),观察抑菌圈大小。抑菌圈10mm作为样品最小抑菌浓度的检测标准。2.6溶血活性检测微量溶血试验评估溶血活性。取健康人血液用3000r/min离心生理盐水洗涤红细胞至上清无色，12min,弃上清，用生理盐水配成2%红细胞悬液，100,50,40,将抗菌肽溶液用生理盐水稀释成500,30,20,10pg/m

14、L勺溶液，加入等体积的2%红细胞100,阳性对照为0.1%TritonX-阴性对照为生悬液，37c孵育1h,理盐水，每个样品设3个平行孔，离540nm波长处测定心去掉完整的红细胞。取上清，各管的吸光度值。稳定性实验热稳定性实验100仙g/mLM菌肽?§液分50,60,70,80,90,100,121c下处理10别在40,min,冰浴冷却，以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为试HCl谱(1.6cmX60cm)分离，用0.05mol/L的Tris-缓冲液(pH7.2)平衡色谱柱，样品上样后用同样的流速为2.0mL/8min,每8min收集1缓冲液洗脱，中国生化药物杂志Chines

15、eJournalofBiochemicalPharmaceutics201年第32卷第4期271验菌，未处理抗菌肽溶液为对照，测定其抑菌圈直径，每个处理样品重复试验3次，根据抑菌圈直径大小确定其热稳定性。2.7.2酸碱稳定性实验1001Ig/mL%菌肽溶液用0.1mol/LHCl溶液或0.1mol/LNaOH溶液调用磷酸盐缓冲整样品pH2.50;室温放置2h,液将样品pH值复调至7.2,未经处理的抗菌肽溶液为对照，以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为试验菌，每个处理样品重复试验3次，根据抑菌圈直径大小确定其酸碱稳定性。3结果3.1大鲤皮肤分泌物中抗菌肽的分离纯化Mr小于10000的溶液超滤液抗菌活性检

16、测，具有明显的抗菌活性。SephadexG-50ft色谱分离，得到2个明显的主峰(图1)。抗菌试验表明，第2个主峰3689管收25柱色谱分集液有明显的抗菌活性。SephadexG离，得到3个明显的峰(图2)。抗菌试验表明，第2个峰1140管收集液有明显的抗菌活性。.蛋白Marker；2.大鲤皮肤分泌液粗提物；3.SephadexG-5吩离25柱色谱分离后样品后；4.SephadexG-1ProteinMarker；2.RawsubstanceThesubstanceaftertheSephadex25chroma-G-50chromatographyThesubstanceaftertheSe

17、phadexG-tography图3Fig.3Tricine-SDS-PAGE电泳ElectrophoresisinTricine-SDS-PAGE3.4抗菌活性检测抗菌肽溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、溶血性链球菌和白色念珠菌均有较强的抗菌活性，最小有效抑菌浓度分别为12,16,16,22,16,18pg/mL3.5溶血性检测血平板检测结果未见溶血现象。说明不同浓度的大鲤皮肤分泌液中抗菌肽溶液对人血红细胞没有溶血作用。图1SephadexG-50765432109876543210,用-V-«*VJIm111oooooooooO凝胶过滤色谱结果3.63.

18、6.1稳定性试验热稳定性试验结果见图4。大鲤皮肤分泌液中抗菌肽对温度有较好的耐受性，样品在2040c抗菌活性没有变化，100c煮沸10min还有抗121c保持10min后无抗菌活性0菌活性,图2SephadexG-25H胶过滤色谱结果Fig.4aureus不同温度处理后的抗菌肽抗菌活性EffectoftheextractsfromtheskinsecretionsoftheAn-driasdavidianusatdifferenttemperatureagainststaphylococcus3.6.2酸碱稳定性试验结果见图5。大鲤皮肤分泌物中抗菌肽在pH5.08.0时抗菌活性稳定，pH9.0

19、以上活性丧失。在pH3.0以下，272中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics201年第32卷第4期Temporin-1Ja由于第11位的赖氨酸分子对比发现，13残基被大冬氨酸残基取代成为阴离子肽。Lai等发现从大蹊铃蟾cDNA库中筛选至阴勺阴离子抗菌肽maximinH5(ILGPVLGLVSDTLDDVLGIL-NH2)仅具备有限的抗菌活性。本实验从大鲤皮肤分泌液中得通过等点聚焦电泳检测显示出较强的到的抗菌肽，图5Fig.5不同pH处理后抗菌肽的抗菌活性Effectofacidandalkalionantagonisticimpacto

20、ftheex-阳离子特征，该小分子肽也是一个碱性肽，我们推测其抗菌机制也可能是通过细胞膜而发挥作用的。目前，虽然从大鲤皮肤分泌液中纯化得到了一种抗菌肽，但仍有许多问题需要阐明，如大鲤皮肤分泌物中是否还存在其它一些活性肽(广谱性的和抗细菌的)以及它们的结构和功能等方面都需要做进一步研究，以获得将大鲤皮肤分泌液中抗菌肽开发为新一代抗感染药物所必须了解的信息。参考文献：1张云.两栖类动物皮肤分泌物及其生物学适应意义一大蹊2006,铃蟾皮肤分泌物蛋白质多肽组的启示J.动物学研究，27(1):101-l12.2苟小军，邹晓勇，杨灿宇.蛙皮多肽抗生素的研究进展J.成2006,25(1):25-30.都大学

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