生物急毒性检测方法-鲤鱼静水式法

1、生物急毒性檢測方法鯉魚靜水式法 NIEA B904.12B 一、方法概要 本方法主要係以鯉魚（Cyprinus carpio）為試驗生物，以靜水式生物毒性試驗方法，檢測生物急毒性，並計算96小時之半數致死濃度（lethal concentration 50%, LC50）或急毒性單位（acute toxic unit, TUa）。 二、適用範圍 本方法適用於地面水體、地下水體、放流水、廢水、污水、水源水質及環境用藥之生物急毒性檢測。 三、干擾 (一)生物馴養及毒性試驗室內若有化學氣體侵入、馴養水或稀釋水含有有毒物質、器皿或試驗容器未洗淨致殘留有毒物質，會影響鯉魚健康且可能造成耐受性改變。 (二

2、)試驗生物有病或健康狀況不佳，影響耐受性。 四、設備及材料 (一)鯉魚：使用全長（上顎前端至尾鰭後端的長度）2.0至3.0公分之鯉魚幼魚（圖一），可購自魚苗繁殖場或自行繁殖。（註1） (二)生物馴養及毒性試驗室：須為獨立之空間，通風良好，無化學氣體影響，且可屏蔽外界干擾（如噪音、震動、強光、人為驚擾等）。馴養及試驗區宜加以區分，以避免污染。光照強度同一般工作亮度。 (三)溫度控制設備：可使用循環式水浴槽、空調等方式，將馴養水溫及試驗水溫控制在25 ± 2。 (四)採樣容器：玻璃或塑膠材質（如摺疊式水箱）。如使用塑膠材質容器，不可重複使用。 (五)馴養容器：玻璃或塑膠材質。 (六)試驗

3、容器：2 L硼矽玻璃燒杯。 (七)量瓶及量筒：硼矽玻璃材質。 (八)溫度監測裝置：須可顯示毒性試驗期間試驗水樣之最高及最低溫度。 (九)溶氧測定儀。 (十)pH計。 (十一)導電度計。 (十二)餘氯計。 (十三)水質硬度計：亦可使用水質硬度檢測試劑組。 (十四)分析天平：可精秤至0.1 mg。 (十五)曝氣設備。 (十六)水循環過濾裝置。 (十七)手操網：大小合適之具握柄軟質尼龍網。 (十八)幼魚飼料：飼料須考量適口性，大小須適合鯉魚幼魚，建議使用市售超細微粒、半沉浮性魚飼料。 五、試劑 (一)試劑水：比電阻值須大於10 Megohms-cm。 (二)馴養水：可使用稀釋水、去氯自來水（註2）、

4、無污染之地下水等作為馴養水。馴養水之硬度應為80至100 mg CaCO3/L，可混合適量之逆滲透水或試劑水進行調整。 (三)稀釋水： 每一 L之試劑水含下列成分（試藥級以上）： 碳酸氫鈉（NaHCO3）96.0 mg 七水硫酸鎂（MgSO47H2O）123.0 mg 氯化鉀（KCl）4.0 mg 二水硫酸鈣（CaSO42H2O）60.0 mg 可根據檢測需求量，依配方比例配製。20 L稀釋水建議配製程序如下： 、將碳酸氫鈉、七水硫酸鎂及氯化鉀加入18 L試劑水中，曝氣隔夜使試藥充分溶解。 、將二水硫酸鈣加入2 L試劑水中，充分攪拌使其完全溶解後，再加入前述18 L液體中。 試藥完全溶解後，劇

5、烈曝氣至少8小時，再測定硬度是否為80至100 mg CaCO3/L。室溫下避光保存不宜超過14天。 (四)參考毒物：氯化鈉，試藥級以上。 (五)10%（v/v）鹽酸或硝酸：試藥級以上。 (六)丙酮：殘量級。 六、採樣及保存 (一)放流水採樣方法參照事業放流水採樣方法（NIEA W109）之規定。水樣量至少10 L（註3）。 (二)採樣時樣品容器應裝至全滿，以減少揮發性物質散失。採樣後立即避光保存於4 ± 2。 (三)水樣必須在採樣後36小時內開始進行確定試驗。 七、步驟 (一)試驗準備 、鯉魚馴養： ()將鯉魚幼魚自魚苗繁殖場等取回後，放入內盛馴養水之馴養容器。 ()馴養容器以曝氣

6、設備曝氣，使溶氧維持在5 mg/L以上，並以水循環過濾裝置維護水質，如有死魚應立即移出。 ()馴養之水溫必須與毒性試驗溫度一致，即25 ± 2，光照時間應維持在每天16 ± 1小時。 ()馴養時間至少7天，毒性試驗開始前7天內，期間幼魚死亡率不得超過10%。 ()幼魚成長速度與馴養之密度及餵食狀況有關，須依實際情況調整馴養容器中幼魚數量及餵食次數。過剩之飼料宜移除以免導致水質惡化。 ()毒性試驗開始前24小時停止餵食。 ()試驗用鯉魚全長應為2.0至3.0公分。試驗前須取5隻以上試驗用鯉魚量測並計算其平均體重，以估算試驗水樣所須體積（註3）。 、試驗容器及相關器材之清洗：

7、()新的塑膠器皿，使用前須用稀釋水潤洗1次。 ()新的玻璃器皿，須用新鮮配製之10%（v/v）鹽酸或硝酸浸泡一夜後，再用試劑水沖洗乾淨。使用前以稀釋水潤洗1次。 ()接觸過樣品的玻璃器皿（如試驗容器、量筒等），如需重複使用，則必須依下列步驟清洗： (a)自來水浸泡15分鐘後，用清潔劑清洗內壁，再以自來水沖洗2次。亦可使用洗瓶機清洗。 (b)以新鮮配製之10%（v/v）鹽酸或硝酸潤洗1次。 (c)以試劑水潤洗2次。 (d)以丙酮潤洗1次。 (e)以試劑水沖洗3次。 (f)進行毒性試驗前，再以稀釋水潤洗1次。 、試驗前之水樣準備： ()先將水樣靜置半小時，待粗顆粒沈降後，再取上層液進行試驗。 ()

8、水樣溫度須調整至25 ± 2。若回溫後溶氧低於3.0 mg/L，應對水樣溫和曝氣，使溶氧升至3.0 mg/L以上。 (二)範圍尋找試驗（range-finding test） 、若不確定樣品之半數致死濃度落於哪一濃度範圍，可先進行範圍尋找試驗。放流水生物急毒性檢測則不須進行範圍尋找試驗。 、建議可將水樣或環境用藥以稀釋水適度進行10倍序列稀釋。每一濃度之試驗水樣體積至少1.5 L（註3），以1個試驗容器盛裝。 、每一濃度之試驗生物總數均為5隻。以手操網將經馴養且全長2.0至3.0公分之鯉魚移入試驗容器，每個容器各放5隻。 、試驗期間鯉魚不得餵食，水溫應控制在25 ± 2，光

9、照應維持每天16 ± 1小時。 、觀察8至24小時，移出死亡之魚並記錄死亡數量。試驗結果作為確定試驗稀釋方式之參考。 (三)確定試驗（definitive test） 、將水樣或環境用藥以稀釋水適度稀釋為5個濃度，相鄰濃度之稀釋倍數不得超過2倍。放流水則以5個固定濃度進行試驗（100%、80%、60%、40%及20%）。每一濃度之試驗水樣總體積至少3 L（註3），以2個試驗容器平均盛裝。 、稀釋完成後，檢測最高濃度試驗水樣之pH、溶氧、導電度及餘氯。另須檢測稀釋水之pH及導電度。 、每一濃度之試驗生物總數均為20隻。以手操網將經馴養且全長2.0至3.0公分之鯉魚移入試驗容器，每個容器

10、各放10隻。 、空白試驗則取2個試驗容器，分別盛裝至少1.5 L之100%稀釋水，以手操網各放入10隻經馴養且全長2.0至3.0公分之鯉魚。 、試驗期間為96小時，水溫應控制在25 ± 2，光照應維持每天16 ± 1小時。試驗期間鯉魚不得餵食。 、開始試驗後，至少於第2、24、48、72及96小時，觀察及移出死亡之鯉魚並記錄死亡數量。 、結束試驗後，須測量並記錄最高濃度試驗水樣之溶氧及pH，並記錄試驗期間之最高及最低水溫。 八、結果處理 (一)死亡判定：死亡之判定須符合下列二條件： 、鰭及鰓的活動停止。 、魚體經輕觸沒反應。 (二)96小時LC50之計算： 、計算各試驗濃度

11、之96小時鯉魚死亡總數及鯉魚死亡百分率： 鯉魚死亡總數2個試驗容器之鯉魚死亡數量加總 鯉魚死亡百分率鯉魚死亡總數 ÷ 20 × 100% 、以下列4種方法計算96小時LC50：圖解法（graphic method）、機率單位法（probit method）、史丕曼卡伯法（Spearman-Karber method）、史丕曼卡伯修正法（trimmed Spearman-Karber method）。方法取捨依圖二之流程作判斷，詳細計算方式參見附錄。 (三)放流水之96小時TUa計算 、TUa為LC50之倒數，即 TUa100% ÷（96小時LC50） 、若放流水水

12、樣5個濃度之鯉魚死亡百分率均小於50%，則96小時之LC50 > 100%，換算之TUa < 1.00。 、若放流水水樣5個濃度之鯉魚死亡百分率均大於50%，則96小時之LC50 < 20%，換算之TUa > 5.00。 、若結果數據不符合前述2種狀況，則依八、(一)之方法計算96小時LC50，再換算TUa。 九、品質管制 (一)試驗魚種必須確認為鯉魚，不可混合其他品種。 (二)執行毒性試驗後之試驗生物須廢棄，不得重複使用。 (三)初始毒性試驗：依本方法執行生物急毒性試驗之實驗室，應先以氯化鈉進行初始毒性試驗，以證明該實驗室之試驗結果具備良好之穩定性。初始毒性試驗之執行

13、方式如下： 、以氯化鈉進行至少5次毒性試驗。 、前述毒性試驗每次皆應使用相同之試驗濃度：氯化鈉以稀釋水溶解並適度稀釋為5個不同濃度，相鄰濃度之稀釋倍數不得超過2倍。5個濃度中，至少須有2個會造成試驗生物部分死亡。 、求取其LC50 平均值及變異係數（coefficient of variation, CV）。生物試驗之CV值不得超過50%。 (四)空白試驗：每次毒性試驗應至少伴隨一空白試驗。若空白試驗之死亡率超過10%，則該次毒性試驗之試驗結果不可採用，必須重做。 (五)參考毒物試驗： 、執行毒性試驗期間，每個月至少執行一次參考毒物試驗。 、新購入之鯉魚馴養後須進行參考毒物試驗，以確定該批鯉魚

14、之敏感度。 、參考毒物試驗濃度須與初始毒性試驗一致。試驗結果（LC50）須建立品質管制圖，建立方法參考環境檢驗品質管制圖建立指引（NIEA-PA105）之第4節，但管制上下限為 ± 2SD。若最近20次參考毒物試驗結果，有2次以上超出管制上下限，則須檢討誤差來源、執行矯正措施並重新進行參考毒物試驗。 十、精密度及準確度 單一實驗室以氯化鈉進行生物急毒性試驗結果，96小時LC50之平均值為9.25 g/L，變異係數為25.2%（n =5）。 十一、參考資料 (一)USEPA.2002. Methods for Measuring the Acute Toxicity of Efflue

15、nts and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. 5th ed. Office of Water, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC. EPA-821-R-02-012. (二)APHA. 2005. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st Edition, Section 8711. American Public Health Association, W

16、ashington, D.C. (三)OECD. 1992. Guideline for Testing of Chemicals, Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test (四)陳弘成，魚類毒性試驗標準方法之研究，EPA-83-E3S5-09-03-02，1994。 (五)李俊宏、柳家瑞，魚類急毒性試驗研究，環保署環境檢驗所環境調查研究年報第2號，1994。 (六)台灣魚類資料庫，中央研究院生物多樣性研究中心。   註1：動物之科學應用應依行政院農業委員會訂定之動物保護法及其相關規定辦理。生物屍體之清除及處理，依一般事業廢棄物相關規定辦理。

17、註2：自來水可使用活性碳過濾或曝氣等方式去氯，但不可使用化學藥劑去氯。 註3：每公升試驗水樣承受之試驗生物總重不得超過2.0 g。 圖一鯉魚幼魚（圖中幼魚全長為2.3公分） 圖二96小時LC50 之計算流程圖附錄LC50計算方法一、機率單位法(一)使用條件、5個試驗濃度之死亡百分率，須有至少一個50%，及至少一個50%。、5個試驗濃度須有2個或2個以上的濃度有部分死亡的情形，也就是死亡百分率數據須有至少2個大於0且小於100%。(二)計算步驟、可使用程式probit.exe進行計算（可參考美國環保署網站）。、probit.exe之輸入範例如圖1，輸出結果如圖2。本程式之結果輸出檔為文字檔，內容

18、包含異質性之卡方檢定結果（Chi-square test for heterogeneity）及LC50計算結果。計算所得之卡方值（Chi-square for heterogeneity（calculated）須小於查表值（tabular value at 0.05 level），LC50之計算結果才可採用。、若數據輸入後出現Overflow或錯誤訊息、結果輸出檔呈現錯誤訊息、或計算所得之卡方值未小於查表值，則改用史丕曼卡伯法進行計算。(三)範例、若結果數據如表1之結果1，因試驗濃度40%及60% 出現部分死亡情形，故使用機率單位法進行計算。、執行probit.exe檔，數據輸入如圖1，結果

19、如圖2。()計算所得之卡方值（5.151）小於查表值（7.815），故機率單位模式適用於此組數據。()LC50為56%，TUa為1.79。二、史丕曼卡伯法及史丕曼卡伯修正法(一)使用條件、5個試驗濃度之死亡百分率數據經過平滑化及調整後，須有至少一組50%，及至少一組50%。、5個試驗濃度之死亡百分率數據經過平滑化及調整後，必須有1個或1個以上的濃度有部分死亡的情形。、若最低濃度之平滑調整死亡百分率為0%，且最高濃度之平滑調整死亡百分率為100%，則使用史丕曼卡伯法。若不符合前述條件，則使用史丕曼卡伯修正法。(二)計算步驟、可使用程式tsk.exe進行計算（可參考美國環保署網站）。、tsk.ex

20、e之輸入範例如圖3，輸出結果如圖4。本程式會自動進行死亡百分率數據之平滑化及調整，而結果輸出內容包含SPEARMAN-KARBER TRIM之數值及LC50計算結果。()若SPEARMAN-KARBER TRIM之數值為0%，代表計算時使用史丕曼卡伯法。()若SPEARMAN-KARBER TRIM之數值非0%，代表計算時使用史丕曼卡伯修正法。(三)範例、若結果數據如表1之結果2，雖然試驗濃度40%及100%出現部分死亡情形，但機率單位法無法計算，故使用史丕曼卡伯法或史丕曼卡伯修正法進行計算。、執行tsk.exe檔，數據輸入如圖3，結果如圖4。()計算所得之SPEARMAN-KARBER TRIM為20.51%，代表計算時使用史丕曼卡伯修正法。()LC50為92%，TUa為1.09。三、圖解法：適用於各濃度均無部分死亡的情形。(一)5個試驗濃度之死亡百分率數據經過平滑化及調整後，須有至少一組50%，及至少一組50%。(二)計算步驟、將死亡百分率數據平滑化：()假設空白試驗之死亡百分率為p0，而樣品5個濃度之死亡百分率依序為p1、p2、p5（由低濃度至高濃度）。若死亡百分率未依循p0p5之順序，則必須進行平滑化。()進行平滑化時，將不符合上述順序之相鄰死亡百分率加總後平均，