选修3《现代生物科技专题》知识点总结B5活页版

1、专题1 基因工程1.基因工程：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。2、基因工程的原理：基因重组一、DNA重组技术的基本工具1.“分子手术刀”限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）作用部位：磷酸二酯键（4）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两

2、种形式：黏性末端和平末端。.六种酶的比较：实质模板作用部位作用结果限制酶切割目的基因或载体不需要磷酸二酯键形成黏性末端或平末端DNA连接酶催化两个双链DNA片段连接起来不需要形成重组DNA分子DNA聚合酶催化脱氧核苷酸单链与单个脱氧核苷酸连接需要（DNA单链）形成新的DNA分子DNA水解酶催化DNA分子水解不需要形成脱氧核苷酸DNA解旋酶催化DNA分子双链解旋不需要碱基对间的氢键形成单链DNA分子RNA聚合酶催化RNA的合成需要（DNA单链）磷酸二酯键形成新的RNA（1）基因重组的三种类型：基因的交叉互换：减I前期；基因的自由组合：减I后期；基因工程：可定向改造生物性状。（2）对限制酶的理解：

3、限制酶是一类酶，而不是一种酶；限制酶的成分均为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强碱或强酸均易使之变性失活；限制酶作为酶类，其催化作用具有高效性、专一性和作用条件较温和等特点；在原核细胞内，限制酶起切割外源DNA，防止寄生生物侵染的作用。如细菌2.“分子缝合针”DNA连接酶(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：相同点：都缝合磷酸二酯键。区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。(2)与DNA聚合酶

4、作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。3.“分子运输车”载体（1）载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。（2）最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。注解：天然质粒需要经过人工改造后，才能用作基因工程中的载体；基因工程中的载体与细胞膜上的载体蛋白的区别基因工程中的载体细胞膜上的载体蛋白来源

5、细菌的质粒、噬菌体、动植物病毒细胞膜上的蛋白质作用将目的基因转移到宿主细胞中，并能在宿主细胞中对目的基因进行大量复制运载要进出细胞的某些物质对限制酶和载体切割位点的说明a.若用于切割载体的限制酶有多个切点，则切割后载体可能丢失含有复制起始点的片段，重组DNA分子进入受体细胞后便不能进行自主复制；b.切点所处位置必须在载体本身需要的基因片段之外，以避免载体因目的基因的插入而失活。二、基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤:目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。第一步：目的基因的获取1.目的基因是指：编码蛋白质的基因 。2.基因组

6、文库：包含了一种生物的所有基因。 部分基因文库（cDNA文库）：只包含了一种生物的一部分基因。3. 人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。反转录法：目的基因的mRNA单链DNA双链DNA（即目的基因）化学合成法：已知蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列目的基因4. PCR技术扩增目的基因（1）概念：PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。（2）原理：DNA双链复制在体外将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数形式扩增（约为2n，n为扩增循环的次数）.5. 过程：可采用PCR扩增仪，进行扩增6

7、. PCR的反应条件：7. 条件8. 作用9. 在一定的10. 缓冲液进行11. 提供相对稳定的pH环境12. 四种脱氧核苷酸13. 作为合成DNA子链的原料14. DNA母链15. 作为DNA复制的模板16. TaqDNA聚合酶17. 催化合成DNA子链18. 引物19. 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸20. 温度控制21. 90-9522. 变性：使双链DNA解聚为单链23. 55-6024. 复性（退火）：两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合25. 70-7526. 延伸：四种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA

8、链比较PCR技术和DNA复制27.28. PCR技术29. DNA复制30. 相同点31. 原理32. 碱基互补配对33. 原料34. 四种脱氧核苷酸35. 条件36. 均需要模板（脱氧核苷酸链作为模板）、引物、酶、ATP等37. 不同点38. 场所39. 生物体外40. 细胞内（主要在细胞核内）41. 解旋42. 方式43. DNA在高温下变性解旋44. DNA解旋酶催化DNA解旋45. 酶46. 耐热的DNA聚合酶47. （Taq DNA聚合酶）48. DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶49. 温度50. 条件51. 需控制温度，在较高温度下进行52. 细胞内的温和条件53. 结果54. 短

9、时间内可形成大量的DNA片段55. 形成完整的DNA分子（3） 过程：第一步：加热至9095DNA解链；第二步：冷却到5560，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至7075，热稳定DNA聚合酶（Taq酶）从引物起始互补链的合成。第二步：基因表达载体的构建（基因工程的核心）1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成：目的基因启动子终止子标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基

10、因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。注解1. 终止子：DNA分子上决定转录停止的三个相邻碱基；终止密码子：mRNA分子上决定翻译停止的三个相邻碱基。2.对构建基因表达载体的说明形成重组DNA分子的过程中，必须用同一种限制酶切割目的基因和载体；目的基因插入载体或者插入受体细胞的染色体DNA中并不能说明基因工程操作成功，还要使目的基因在受体细胞中稳定存在和表达，并且可以遗传给下一代；目的基因能在受体细胞中表达，产生相应性状的原因是：不同生物共用一套遗传密码；组成基因表达载体的四部分相互协作，缺一不可，共

11、同维持目的基因的表达；基因表达载体虽然都由四部分组成，但由于受体细胞（动物、植物、微生物）不同，基因表达载体的构建也会有差别。3.基因表达载体应具备的条件对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动；能自我复制，通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失；具有标记基因，以便于鉴定目的基因是否进入受体细胞；重组DNA分子大小应适宜，以方便操作。2.常用的转化方法：（1）将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。选农杆菌的原因：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。（2） 将目的基因导入动物细胞：最

12、常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。选受精卵作为受体细胞原因：因为受精卵发育的全能性最高，体积大，容易操作。（3）将目的基因导入微生物细胞：Ca2+ 处理法。原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。第四步：目的基因的检测和表达1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插

13、入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。如果显示杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。杂交带3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原抗体杂交。杂交带4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。5.转化方法：受体细胞方法受体特点植物细胞（常用）农杆菌转化法：将目的基因插入到农杆菌的Ti质粒的TDNA上转入农杆菌用农杆菌侵染植物细胞将目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上植物产生新性状或蛋白质产物受精卵、体细胞经济、有

14、效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物基因枪法受精卵、体细胞成本较高，常用于单子叶植物花粉管通道法简便、经济，我国科学家独创动物细胞显微注射法：将含有目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵经胚胎早期培养后移植到雌性动物输卵管或子宫内发育获得具有新性状的动物具有体积大、易操作、经培养可直接表达性状的优点最为有效的将目的基因导入动物细胞的方法微生物细胞Ca2+处理受体细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子具有繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少等优点简便、经济、有效目的基因的检测与鉴定类型步骤检测内容方法结果显示分子水平检测导入检测（复制检测）

15、目的基因是否插入受体细胞染色体的DNA上DNA分子杂交技术是否成功显示杂交带表达检测转录检测目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术翻译检测目的基因是否翻译出蛋白质抗原抗体杂交技术个体水平鉴定是否具有抗性及抗性程度；基因工程产品与天然产品的活性是否相同对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验；比较基因工程产品与天然产品的活性是否赋予了预期抗性或蛋白质活性（三）基因工程的应用1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。2.动物基因工程：提高动物生长速度（外源生长激素）、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用

16、。（四）蛋白质工程（1）概念：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（2）蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质。（3）蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。（4）基本途径：从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。特别注意：蛋白质工程中，直接需要进行操作的对象是基因结构。专题2 细胞工程1.细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞

17、水平或细胞器水平上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。根据操作对象的不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程两大技术。一、植物细胞工程 1.理论基础（原理）：细胞全能性（具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞都具有发育成完整个体生物体的潜能）全能性表达的难易程度：受精卵干细胞生殖细胞体细胞：植物细胞动物细胞（动物细胞中的细胞核具有全能性）受精卵>生殖细胞（即配子，包括精子和卵细胞）>体细胞；体细胞：分化程度低>分化程度高的；幼嫩的>衰老的；分裂能力强的>分裂能力弱的。二、植物细胞表现出全能性的条件1.离体条件 2.无菌操作 3

18、.适宜物质的诱导和调节（激素主要是生长素和细胞分裂素）4.种类齐全，比例适合的营养物质 5.温度、酸碱度、光照等条件的控制。注解：（1）对细胞全能性的说明构成生物体的所有体细胞都是由一个受精卵发育而来的，都含有相同的遗传物质，都含有本物种全套的遗传信息，因而每个体细胞都有发育成完整生物个体的潜能。在生物的生长发育过程中，生物体内的细胞并不会表现出全能性，而是分化成各种组织和器官，这是因为细胞内的基因在特定的时间和空间条件下选择性地表达。2.植物组织培养技术 再分化 脱分化（1）概念：植物组织培养体就是在无菌和人工控制条件下，将离体生物植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培

19、养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。（试管苗）（2）过程：离体的植物器官、组织或细胞 愈伤组织 胚状体或丛芽 植物体胡萝卜的组织培养案例注意事项：愈伤组织：特点排列疏松、不定形、高度液泡化的薄壁组织。选取胡萝卜形成层的部位进行脱分化的原因：分裂旺盛、全能性较高，容易诱导形成愈伤组织。脱分化无光(形成愈伤组织之前需避光）、再分化需光照（长出芽和茎后需进行光合作用制造营养物质）。（3）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产（培养到愈伤组织阶段）。植物繁殖的新途径微型繁殖：快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。作物脱毒：采用茎尖组织培养技术来除去病毒

20、（因为植物分生区附近的病毒极少或没有）。人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。人工种子的优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和运输。作物新品种培育单倍体育种：a 过程：植株（AaBb）通过减数分裂得到花粉（AB、Ab、aB、ab）对花粉进行花药离体培养（技术是植物组织培养），得到单倍体植株（基因型分别为AB、Ab、aB、ab四种）对其幼苗时期进行秋水仙素处理；得到了正常的纯合二倍体植株（基因型分别为AABB、AAbb、aaBB、aabb四种）。b 优点：明显缩短育种年限。突变体利用：在组织培养中会出现突变体，通过从有用

21、的突变体中选育出新品种（如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体） 细胞产物的生产通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们能够产生大量的细胞产物。（4） 地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。植物组织培养过程中的注意要点（1）植物组织培养成功的关键是避免微生物的污染，因此，培养基以及所有操作工具都应进行消毒和灭菌，谨防杂菌污染。（2）需在无菌条件下操作。（3）接种、继代培养的转移都应在接种箱内进行。3.光照：对于植物组织培养来说，光照条件非常重要。在愈伤组织的诱导阶段往往要避光培养，有利于细胞的脱分化产生愈伤组织。当愈伤组织分化出芽和叶时，一定要有光照

22、，有利于叶片内叶绿素的合成。生长素和细胞分裂素在植物组织培养中的作用使用顺序与实验结果生长素/细胞分裂素的比值与结果先生长素，后细胞分裂素有利于分裂但不分化比值高时促进根分化，抑制芽形成先细胞分裂素，后生长素细胞既分裂也分化比值低时促进芽分化，抑制根形成同时使用分化频率提高比值适中促进愈伤组织生长二、植物体细胞杂交技术1.植物体细胞杂交的概念将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。2.植物体细胞杂交过程酶解法制备原生质体原生质体融合杂种细胞再生出细胞壁脱分化形成愈伤组织再分化形成杂种植株。步骤做法原生质体的获得酶解法（纤维素酶、果胶酶）去除细胞壁，

23、得到原生质体杂种细胞的形成通过一定的技术手段（物理法：离心、振动、电激等；化学法：用聚乙二醇等作为诱导剂）进行人工诱导，实现原生质体的融合杂种植株的产生对杂种细胞，用植物组织培养的方法进行培育（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。深入理解植物体细胞杂交技术1. 植物体细胞融合依据的生物学原理：细胞膜的流动性；植物组织培养的理论基础：细胞的全能性。2.酶解法：保证了原生质体的活性。植物体细胞杂交中融合成功的标志：杂种细胞再生出细胞壁。3.植物体细胞A和B融合成功后，将得到AB型、AA型和BB型三种

24、细胞，但只有AB型是杂种细胞，因此，在细胞融合后还应有一个筛选杂种细胞的过程。4.变异类型：染色体数目的变异。5.植物体细胞杂交后，杂种细胞的染色体组数是两个物种的总和，形成异源多倍体。因为细胞内每条染色体仍然有其同源染色体，所以从理论上讲均是可育的，但育性会降低。6.植物体细胞杂交的终点：培育成杂种植株，杂种植株的特征：具备两种植物的遗传特征，原因是杂种植株中含有两种植物的遗传物质。比较植物体细胞杂交和多倍体育种植物体细胞杂交多倍体育种不同点原理原生质体融合和植物组织培养染色体数目变异方法通过原生质体融合和植物组织培养得到杂种植株用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，使染色体数目加倍染色体来源和数

25、目变化通过植物体细胞杂交得到的杂种植株，其染色体数不一定和原来的是倍数关系，因为它的染色体数是两个细胞的染色体数之和，且一般来自两种不同的植物通过染色体加倍得到的多倍体植株，其染色体数和原来的是倍数关系，且来自同一个体，加倍的是同源染色体相同点都采用一定的方法，通过改变细胞或植株的染色体数目来改变遗传物质，从而改变生物体的性状，从中选育出符合人们要求的新品种植物细胞工程的实际应用一、植物繁殖的新途径1.微型繁殖：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术叫做植物的微型繁殖技术（快速繁殖技术）。（2）优点保持优良品种的遗传特性；高效快速地实现种苗的大量繁殖。注：高保真、速度快、工厂化生产。2.作物脱

26、毒（1）实际问题：生产上许多进行无性繁殖的作物受到病毒的侵染，并在作物体内逐年积累，导致作物的产量降低，品质变差。（其相反面即是脱毒作物的优点）（2）解决方法：选取植物无毒组织（如茎尖）进行组织培养，获得脱毒苗。3.人工种子（1）概念：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子（如图）。人工种子在适宜条件下同样能够萌发长成幼苗。（2）优点固定杂种优势，后代无性状分离：人工种子在本质上属于无性繁殖，一旦获得优良品种，可以保持杂种优势。快捷高效的繁殖方式。可人为控制植物的生长发育与抗逆性，不受季节、气候和地域的限制：人工胚乳中除了含有胚状体发育所需的营养物质

27、外，还可以添加除草剂、防病虫农药、抑制休眠的物质、对植物生长有益的细菌及植物激素类似物等，使其具备抗逆性和耐贮性等优良特性，有利于幼苗茁壮成长，提高作物产量。植物分生区附近病毒少：在植物分生区附近，细胞分裂十分迅速，病毒来不及侵入，因此就成为植物体相对无病毒的特殊区域。人工种子的组成及作用1.胚状体：它与正常受精卵发育形成的胚有类似的结构和发育过程。2.人工胚乳：供胚状体维持生命力和保证其在适宜的环境条件下生长发育。3.人工种皮：具有保护作用二、作物新品种的培育1.单倍体育种（1）过程：花药离体培养（对花粉进行组织培养）秋水仙素处理（萌发的种子或幼苗）。（2）优点：获得的后代为纯合子，可明显缩

28、短育种年限（一般为2年）。2.突变体的利用：产生突变的个体中可以筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。缺点：技术相当复杂，需要与杂交育种结合，其中的花药离体培养过程需要组织培养技术的支持，多限于植物。 植物细胞培养与植物组织培养的区别：植物细胞培养是在植物组织培养技术的基础上发展起来的。细胞培养的目的不是使细胞形成组织以至更多的植物体，而是通过大规模的细胞培养获得人们需要的次生代谢产物。（二）动物细胞工程 1. 动物细胞培养技术（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（

29、动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）剪碎用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液（目的是使每个细胞能与培养液接触）转入培养瓶中进行原代培养（10代以内）贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。注：一般来说，细胞在传代培养至1050代左右时，增值会逐渐缓慢，以至于完全停止，这是少数细胞的核基因（遗传物质）发生变化，获得不死性，朝着等同于癌细胞的方向发展。目前使用的或冷冻保存的正常

30、细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核基因（遗传物质）。（4）动物细胞培养需要满足以下条件无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。合适的营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清(或血浆）等天然成分。适宜的温度和PH：适宜温度：哺乳动物多是36.50.5；适宜pH：7.27.4。气体环境：95%空气5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。制作（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体

31、、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。原代培养剪碎加培养液胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理取动物组织块 单个细胞 细胞悬液 细胞传代培养剪碎胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理贴壁生长 细胞悬液 细胞群体细胞传代培养代数的特点：传代培养的细胞一般传至10代后就不易传下去了，一般来说，细胞在传至1050代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能会发生变化。当继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，所以目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型。动物组织要分散成单个细胞培养的原因：分散成单个细胞后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代

32、谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都比较困难，因此，这些细胞在体外长时间生存和生长就比较困难。同时，分散成单个细胞培养，可使在细胞水平上操作的其他技术得以实现。动物细胞培养与植物组织培养的区别植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞的增殖培养基固体，需加植物激素液体，需加动物血清结果培育成完整的植株培育成细胞群体培养目的快速繁殖，培育无病毒植株等获得细胞或细胞代谢产物等2.动物体细胞核移植技术和克隆动物（无性繁殖）（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞体积大，容易操作

33、；营养丰富，可以提供充足的营养，细胞质不会抑制细胞核全能性的表达。（3）体细胞核移植的大致过程是：高产奶牛（提供体细胞）进行细胞培养（动物培养技术），同时采集卵母细胞，在体外培养到减中期的卵母细胞，去核将供体细胞注入去核卵母细胞通过电刺激使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎将胚胎移入受体（代孕）母牛体内（胚胎移植技术）生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛。取具有优良性状 细胞 供体个体的供体细胞 培养 细胞 细胞 构建重收集卵巢，采 体外 减数第二次 去核的卵 融合 组胚胎集卵母细胞 培养 分裂中期 母细胞 得到克隆动物（与供体的遗传物质基本相同） 移入受体（代孕）母体内注：体细胞核

34、移植技术中的犊牛并非是对体细胞供体母牛100%的复制，其原因主要有：生物的性状受体细胞核基因和细胞质基因共同控制；生物的性状受环境因素的影响。（4）体细胞核移植技术的应用：加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；保护濒危物种，增大存活数量；生产珍贵的医用蛋白；作为异种移植的供体；医学上用于组织器官的移植等。（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。3.动物细胞融合技术（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本

35、相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇（PEG）、灭活的病毒、电刺激等。（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。4.单克隆抗体（1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。（2）单克隆抗体的制备过程：对免疫小鼠注射特定的抗原蛋白，目的是使小鼠产生抗原刺激过的B淋巴细胞（效应B细胞）；提取抗原刺激过的B淋巴细胞；同时用动物细胞培养的方法培养骨髓瘤细胞并提取；促使抗原刺激过的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合；（注：融合的结果是出现多种杂交

36、细胞，有不符合要求的：如有2个B淋巴细胞融合的细胞、有2个骨髓瘤细胞融合的细胞等，所以要用特定的选择培养基进行筛选。）在特定的选择性培养基上筛选出融合的杂交瘤细胞（杂种细胞），该杂交瘤细胞的特点是既能迅速大量增殖，又能产生专一的抗体；对上述杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，筛选出能产生所需特异性抗体的杂交瘤细胞；最后将杂交瘤细胞在体外做大规模培养（培养基中培养）或体内培养（注射入小鼠腹腔内增殖），从细胞培养液或小鼠腹水中可得到大量的单克隆抗体。培养骨髓瘤细胞（3）杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体。（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。（5）单克隆抗体

37、的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。注：动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：细胞工程植物体细胞杂交动物细胞融合理论基础细胞的全能性、细胞膜的流动性细胞增殖、细胞膜的流动性融合前处理酶解法去除细胞壁（纤维素酶、果胶酶）注射特定抗原，免疫处理正常小鼠诱导融合方法物理法:离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG）物理法:离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG）生物法：灭活的病毒诱导过程用酶去壁原生质体融合（不同物种）杂种细胞杂种

38、植株用酶（常用胰蛋白酶）处理组织单个细胞融合（不同物种）杂种细胞用途和意义克服远缘杂交的不亲和障碍应用：白菜-甘蓝等杂种植株制备单克隆抗体、诊断、治疗、预防疾病，例如“生物导弹”治疗癌症专题3 胚胎工程1.胚胎工程的概念：指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的需求。一、体内受精和早期胚胎发育（一）精子和卵子的发生1.精子的发生（睾丸）：精原细胞先有丝分裂增值变多后每个精原细胞减数分裂形成4个精细胞，精细胞再变形成精子；变形过程中，细胞核为精子头的主要部分，高尔

39、基体发育为顶体，中心体演变为精子的尾，线粒体在尾基部形成线粒体鞘膜，其他物质浓缩为原生质滴直至脱落。（线粒体为精子运动提供能量）项目精子发生卵子发生不同点场所睾丸的曲细精管内（场所唯一）卵巢和输卵管内（场所不唯一）时间初情期开始，直到生殖机能衰退胚胎时期性别分化以后过程特点MI和MII是连续的，需变形；细胞质均等分配MI和MII是不连续的，不需要变形；只有MII中的第一极体分裂为第二极体时细胞质均等分配，其余过程中细胞质都是不均等分配结果形成4个精子形成1个卵细胞和3个极体相同点原始生殖细胞通过有丝分裂进行增殖；生殖细胞通过减数分裂发育成熟，形成的子细胞中染色体数目减半；染色体的行为和数目变化

40、的过程是一样的；产生的子细胞数目都是四个2.卵子的发生（卵巢）：在胎儿时期，卵原细胞进行有丝分裂不断增加其数量，并进一步演变成初级卵母细胞（被卵泡细胞包围），减数第一次分裂是在排卵前后完成，形成次级卵母细胞和第一极体进入输卵管准备受精；减数第二次分裂是在受精过程中完成的。（二）受精1.精子获能（在雌性动物生殖道内）；2.卵子的准备（排出的卵子要在输卵管中进一步成熟到减中期才具备受精能力）；3.受精阶段（卵子周围的结构由外到内：放射冠、透明带、卵细胞膜）：顶体反应：精子释放顶体酶溶解卵丘细胞之间的物质，穿越放射冠。透明带反应（防止多精子入卵受精的第一道屏障）：顶体酶可将透明带溶出孔道，精子穿入，

41、在精子触及卵细胞膜的瞬间阻止后来精子进入透明带的生理反应。卵细胞膜反应（防止多精子入卵受精的第二道屏障）：精子入卵后，卵细胞膜会立即发生一种生理反应，拒绝其他精子再进入卵内的过程。精子尾部脱落，原有核膜破裂形成雄原核，同时卵子完成减分裂，形成雌原核。（注意：受精场所是母体的输卵管，当在卵细胞膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时，说明卵子已经完成了受精，这是判断卵子是否受精的重要标志）。（3） 胚胎发育1.卵裂期：细胞进行有丝分裂，数量增加，胚胎总体积并不增加，或略有减小；2.桑椹胚：32个细胞左右的胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹，每一个细胞都是全能细胞；3.囊胚：细胞开始出现分化，其中个体较大

42、的细胞叫内细胞团将来发育成胎儿的各种组织；而滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘；胚胎内部逐渐出现囊胚腔；（注：囊胚的扩大会导致透明带的破裂，胚胎伸展出来，这一过程叫孵化）。4. 原肠胚：内细胞团表层形成外胚层，下方细胞形成内胚层，由内胚层包围的囊腔叫原肠腔。关于胚胎发育的特别提醒1.个体发育的过程：2.胚胎发育的起点：受精卵，受精卵形成后即在输卵管内进行有丝分裂，此时胚胎开始发育，直到发育成为成熟的胎儿。3.个体发育的起点：受精卵，终点：性成熟的个体。4.受精卵是新生命的第一个细胞，其全能性最高。细胞全能性随发育的深化而降低。5.桑椹胚阶段以前的细胞均未分化，细胞全能性最高，是胚胎分割的最佳时期。

43、6.个体发育过程中，从囊胚阶段开始细胞分化，但此阶段细胞的全能性仍很高，可用于胚胎分割。7.孵化是在囊胚阶段发生的。2、 体外受精和早期胚胎培养1.体外受精（属于有性生殖）：哺乳动物的体外受精主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等几个主要的步骤。3、 动物种类4、 卵母细胞的采集方法5、 采集后的培养6、 实验动物（小鼠、兔）以及家畜猪、羊等7、 超数排卵：用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，再从输卵管中冲取卵子8、 直接与获能的精子在体外受精9、 大家畜或大型动物（牛、马等）10、 从已屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞11、 在体外经人工培养成熟后才能与获能的精子受精直接从活体动物的卵巢中

44、吸取卵母细胞卵母细胞的采集和培养：对体型小的动物用促性腺激素处理，从输卵管冲取卵子（可直接受精）；对体型大的动物从卵巢中采集卵母细胞（要在体外培养成熟到减中期）。精子的获取：假阴道法、手握法和电刺激法；获能 对啮齿动物、兔、猪等的精子用培养法（放入人工配制的获能液中）；对牛、羊等精子用化学法（放在肝素或钙离子载体溶液中）。对精子进行获能处理方法名称方法内容适用对象培养法将取自附睾的精子，放入人工配制的获能液中，培养一段时间啮齿动物、家兔、猪等化学诱导法将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中，用化学药物进行诱导牛、羊等家畜受精：一般情况下都可以在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精

45、过程。哺乳动物的体外受精主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等几个主要步骤。对体外受精技术的说明1.哺乳动物体内胚胎的形成需要经过：精子和卵细胞的发生受精胚胎发育三个阶段。事实上体外受精技术也是按照这一过程操作的，唯一不同的是采用了人工操作技术。2.获取的卵母细胞必须在体外培养到MII中期。3.不同动物，采集卵子和精子的方法不同，精子体外获能的方法也不同。4.获能的精子和培养成熟的卵子的体外受精过程必须在获能溶液中或专用的受精溶液中完成。精子获能处理前对精子进行离心处理的原因：精液由精子和精清（精浆）两部分组成。精液中含有一种能抑制精子获能的物质，在一般情况下，精液中的精子无法获能。因此，

46、在精子获能前应进行离心处理，除去精清以利于精子获能。2.胚胎的早期培养：培养液成分：无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清等物质。当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。比较试管牛和克隆牛：试管动物技术是指通过人工操作使卵子和精子在体外成熟和受精，并通过培养使受精卵发育为早期胚胎后，再经移植产生后代的技术。其主要技术操作是体外受精和胚胎移植。试管牛和克隆牛的培育都属于胚胎工程的范畴，但从生物生殖的角度看，两者有着本质的区别：培育克隆牛属于无性生殖；而培育试管牛的过程，涉及精子和卵子有性生殖细胞的结合，属于有性生殖。胚胎工程的应用及前景（一）胚胎移植1.概念：胚胎移

47、植是指将雌性动物体内的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。2.优点：可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，大大缩短了供体本身的繁殖周期。3.地位：如转基因、核移植，或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎，都必须经过胚胎移植技术才能获得后代，是胚胎工程的最后一道“工序”。4.胚胎移植的生理学基础：第一，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的（对供体和受体进行同期发情处理）；第二，早期胚胎形成后处于游离状态，为胚胎的收集提供可能；第三，受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应；第四，移入受体的供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。4.胚胎移植的程序：对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。配种或人工授精。对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后