药品微生物限度检查法

1、药品微生物限度检查法药品微生物限度检查法2022-4-242l微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法，也是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。检查项目包括染菌量及控制菌检查。微生物限度检查法起草的指导思想微生物限度检查法起草的指导思想l较完善检查法：也是目前国际上常用的一种方法。是以琼脂平板上的细菌、霉菌或酵母菌形成的一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌、霉菌和酵母菌的菌落数。l增加试验的可操作性l 使方法更具科学性，保证检验结果的准确性。2022-4-2432022-4-

2、244l检验全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁净度10000级和局部洁净度100级单向流空气区域内进行，以防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按中华人民共和国国家标准GB/T 1629216294-1996 医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法进行洁净度验证。洁净级别洁净级别洁净级别 尘粒数/m3浮游菌个/m2沉降菌个/0.5h微粒直径0.5um微粒直径5um1003,50005110000350,000200010031000003,500,00020,000500102022-4-245检验量检验量l检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或 cm2）l一般应

3、随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。l除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；中药膜剂为50cm2l贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。l要求检查沙门菌的供试品其检验量应增加10g或10ml2022-4-2462022-4-247l供试液的制备供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液取适宜的方法制备供试液。供试液 制备若需用水浴加温时，温度不应超过制备若需用水浴加温时，温度不应超过45。供试液从制备至加入检验用培。供试液从制备至加入检验用培 养基，不得超过养基，不得超过1小时。

4、小时。l除另有规定外，常用的供试品制备方法如除另有规定外，常用的供试品制备方法如下：下：2022-4-248l（1）液体供试品）液体供试品 取供试品取供试品10ml,加稀释剂至加稀释剂至100ml中混匀，作为中混匀，作为1:10 供试液。水溶性液体供试液。水溶性液体制剂可用混合的供试品原液直接作为供试液。制剂可用混合的供试品原液直接作为供试液。l（2）固体、半固体或黏稠性供试品）固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品取供试品10g加稀释剂至加稀释剂至100ml中，用匀浆仪或其它适宜中，用匀浆仪或其它适宜的方法，混匀后，作为的方法，混匀后，作为1:10供试液。供试液。 供试液的制备供试液的制备20

5、22-4-249l非水溶性供试品l取供试品5g(5ml)，加入司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的无菌溶化混合物（温度低于45）的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45左右的稀释剂至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20供试液。特殊供试液制备方法特殊供试液制备方法特殊供试液制备方法特殊供试液制备方法l取供试品10g，加至含玻璃珠和20ml的无菌十四烷酸异丙酯的容器中，充分振摇，使供试品溶解，再加入约45的稀释剂，振摇5-10分钟，萃取，待油水明显分层，取其水层作为1:10供试液。l十四烷酸异丙酯的灭菌方法：采用薄膜过滤法除菌，选用孔径为0.22um的脂

6、溶性滤膜，在140干热灭菌2小时。2022-4-2410l特殊供试液制备方法特殊供试液制备方法l非水溶性膜剂供试品 取50cm2,剪碎，加适量的稀释剂（通常为每1ml或每2ml含1cm2）,浸泡，振摇，以供试品浸液作为1:10或1:20供试品。2022-4-2411特殊供试液制备方法特殊供试液制备方法l肠溶及结肠溶制剂供试品l取供试品10g，加至100ml pH6.8磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）中或pH7.6磷酸盐缓冲液（结肠制剂），置45水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。2022-4-2412特殊供试液制备方法特殊供试液制备方法l具抑菌活性的供试品l当供试品有抑菌活性时，应消除其抑菌活

7、性后，再依法检查。l常用的方法有：培养基稀释法离心沉淀集菌法 3000转/分离心20分钟，500转/分离心5分薄膜过滤法中和法2022-4-2413菌数报告规则菌数报告规则 l细菌数酵母菌平均菌落数在30-300，霉菌平均菌落数在30-100 之间的稀释级作为菌数报告的依据。 l当仅有个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。2022-4-2414菌数报告规则菌数报告规则当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌

8、数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。当出现比值大于5或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。2022-4-2415菌数报告规则菌数报告规则l当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。l各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。2022-4-2416菌数报告规则菌数报告规则各各稀释级菌落平均数比值菌落数报告1：10 1：102 1：103 不可计不可计不可计39240.5164

9、2952714119020466041.62.210.2164003775027100异常2405160003800027000240102022-4-2417操作要点操作要点l一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成，因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colony forming unity, cfu）l供试品检验的全过程必须符合无菌技术要求。l培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按灭菌法（见附录）的要求采用验证合格的灭菌程序灭菌。2022-4-2418操作要点操作要点l作供试品稀释时，每一稀释级都要更换吸管。l细菌培养48h，真菌培养72h，计数。如菌落

10、极小，不易辨认可适当延长培养时间。再点计菌落数。l含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵菌数，并且合并计数。l若同一稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。l使用灭菌吸管时，管尖不要接触可能污染的任何容器或用具。l供试液稀释及注皿时应振摇后取均匀的供试液，以免造成实验误差。2022-4-2419操作要点操作要点l培养基的分装量不得超过容器的2/3以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。l培养基配制后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖。l灭菌后的培养基应保存在2-25 防止被污染，可在三周

11、内用毕。l已溶化的培养基应一次用完，一般开启后不宜再用，更不要反复加热溶化 l注皿时培养基应在451，高于45时易造成细菌受损或致死，低于45时易凝固，影响混匀，因此使用前可用水浴保温效果较好。l倾注培养基于平皿中与样品摇匀时，切勿溅到皿盖边和皿盖上，以免影响实验结果。 2022-4-2420操作要点操作要点l采用薄膜过滤法时，水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗液、冲洗量及冲洗方法同

12、方法验证试验。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。2022-4-2421操作要点操作要点每张滤膜取相当于1g或1ml供试品的供试液直接过滤或加至适量稀释剂中混匀，过滤，用适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法及冲洗量同“计数方法的验证”，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜，滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影响微生物生长。 2022-4-2422操作要点操作要点 2022-4-2423异常情况处理异常情况处理l菌落蔓延：培养中由于一些菌落蔓延生菌落蔓延：培养中由于一些菌落蔓延生长而影

13、响另一些菌落生长，甚至掩盖了另长而影响另一些菌落生长，甚至掩盖了另一些菌落，干扰计数。一些菌落，干扰计数。l原因：有动力和培养环境湿度过大造成，原因：有动力和培养环境湿度过大造成，给动力菌造成泳动的条件，促使形成蔓延给动力菌造成泳动的条件，促使形成蔓延菌落机会增多。菌落机会增多。2022-4-24242022-4-2425l加TTC：于倾注培养基前，在每1000ml营养琼脂内加入灭菌1%TTC溶液1ml混匀后倾注平皿。l开盖干燥：将已凝固的琼脂平板开盖，倒置斜放于净化工作台上，开机1-2h后合盖，再放培养箱中 换陶瓦盖：将已凝固的琼脂平板盖换上新近干热灭菌的陶瓦盖。2022-4-2426异常菌

14、数报告异常菌数报告 在特殊情况下，营养琼脂培养基上生长的霉菌、酵母菌多于玫瑰红钠琼脂培养基上菌落数则以营养琼脂平板的霉菌、酵母菌菌落数报告，反之如玫瑰红钠琼脂平板生长了细菌，且多于营养琼脂平板的菌落数，则以玫瑰红钠琼脂平板的细菌数报告 2022-4-2427 控制菌的检查控制菌的检查l 大肠埃希菌检验程序大肠埃希菌检验程序l 供试品 供试液 l 不少于100ml的 胆盐乳糖增菌液 l 35371824h l 取 0.2ml l 5mlMUG培养基中 35375、24hl 366nm紫外光下观察 l 加靛基质试剂 l lMUG阳性，靛基质 阳性 MUG阴性，靛基质 阳性lMUG阴性，靛基质 阴性

15、 MUG阳性，靛基质 阴性l 取胆盐乳糖培养液划线 l 报告 曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板l 3611824h 阳性 l阴性 l l镜检、适宜的生化试验 报告l 2022-4-2428大肠埃希菌检验程序大肠埃希菌检验程序l 供试品 供试液 l 不少于100ml的 胆盐乳糖增菌液 l 35371824h l 取 0.2ml l 5mlMUG培养基中 35375、24hl 366nm紫外光下观察 l 加靛基质试剂 l lMUG阳性，靛基质 阳性 MUG阴性，靛基质 阳性lMUG阴性，靛基质 阴性 MUG阳性，靛基质 阴性l 取胆盐乳糖培养液划线 报告 曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板l 3

16、611824h 阳性 l 阴性 l l镜检、适宜的生化试验 报告l l 报告2022-4-2429注意事项注意事项l配制MUG培养基时，务必校正pH值 ，灭菌后pH不得过7.4否则pH值偏高，MUG分解本身则显荧光。l供试品培养液接种于MUG培养基中，培养时间一般在4h、24h观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养时间至48h再观察结果。由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完全相同，对底物和底物的浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养时间、温度；pH的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响。2022-4-2430注意事项注意事项l观察供试品

17、MUG管时，可与阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外灯下观察。l在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上生长的可疑菌落，务必挑选2-3个以上菌落分别做IMViC试验鉴别。l在IMViC试验中，以灭菌接种环沾取菌苔，首先接种于枸椽酸盐琼脂斜面上，然后再接种于蛋白胨水等其它培养基上，切务将培养基带入枸椽酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果。2022-4-2431大肠菌群大肠菌群大肠菌群作为水质粪便污染的指示菌已有大肠菌群作为水质粪便污染的指示菌已有80多年历史。大肠菌群的定多年历史。大肠菌群的定义：是指义：是指37生长时能发酵乳糖，在生长时能发酵乳糖，在24h内产酸产气的革兰阴性无内产酸产气的革兰阴

18、性无芽孢杆菌，符合上述定义的细菌除大肠埃希氏杆菌属外，还包括肠芽孢杆菌，符合上述定义的细菌除大肠埃希氏杆菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸椽酸菌属、克雷伯菌属等，实际上基本包括杆菌科的肠杆菌属、枸椽酸菌属、克雷伯菌属等，实际上基本包括人和了正常家畜肠道内的全部需氧的革兰阴性杆菌，较大肠埃希菌人和了正常家畜肠道内的全部需氧的革兰阴性杆菌，较大肠埃希菌更具代表性，且存活时间较长。故检出大肠埃希菌，一般认为药品更具代表性，且存活时间较长。故检出大肠埃希菌，一般认为药品受粪便的近期污染；而检出大肠菌群，则表示药品受粪便的近期或受粪便的近期污染；而检出大肠菌群，则表示药品受粪便的近期或远期污染。以大肠

19、菌群作为口服药品微生物限度标准的控制菌，具远期污染。以大肠菌群作为口服药品微生物限度标准的控制菌，具有广泛的卫生学意义，更能反映药品的卫生质量。有广泛的卫生学意义，更能反映药品的卫生质量。2022-4-2432操作方法操作方法取乳糖胆盐发酵管取乳糖胆盐发酵管3支，分别加入支，分别加入1:10供试液供试液1ml (供试品量供试品量0.1g或或0.1ml), 1:100供试液供试液1ml(供试品供试品量量0.01g或或0.01ml),1:1000供试液供试液1ml（供试品量（供试品量0.001g或或0.001ml），同时作阴性对照，各管置），同时作阴性对照，各管置361培养培养18-24h, 阴性

20、对照应无菌生长。阴性对照应无菌生长。2022-4-2433结果判断结果判断 乳糖胆盐发酵管若无菌生长，或有菌生长但不产酸产气（或产酸不产气）报告 未检出大肠菌群；如有产酸产气，应做确证试验，将产酸产气的发酵管划线接种于EMB或麦康凯琼脂平板上培养18-24h，如平板上无菌落生长可判该管未检出大肠菌群。如平板上有菌落生长并与药典所列的菌落形态特征相符或疑似，镜检为革兰阴性无芽孢杆菌的菌落，应取上述平板上的可疑菌落4-5个各接种1支乳糖发酵管，培养2448h,凡产酸产气，革兰阴性无芽孢杆菌，判该管检出大肠菌群，反之判该管未检出大肠菌群。2022-4-2434沙门菌检验程序沙门菌检验程序l 供试品供

21、试品10g(10ml) l 200ml的营养肉汤中的营养肉汤中 35371824h 四硫磺酸盐增菌液四硫磺酸盐增菌液l 35371824h l DHL，EMB或或MacC 35371824h l 无典型菌落无典型菌落 三糖铁琼脂（三糖铁琼脂（TSI）l 35371824h l 报告报告 斜面未见红色（斜面黄色）斜面未见红色（斜面黄色） 斜面红色（黄色）斜面红色（黄色）l 底层未见黄色（底层无黑色）底层未见黄色（底层无黑色） 底层黄色（黑色）底层黄色（黑色） l l 血清凝集、生化试验血清凝集、生化试验 l 报告报告2022-4-2435注意事项注意事项 l在作氰化钾试验时，应注意密封管口，夏天

22、分装在作氰化钾试验时，应注意密封管口，夏天分装培养基宜在冰浴中进行，防止氰化钾分解，产生氢培养基宜在冰浴中进行，防止氰化钾分解，产生氢氰酸逸出，致使培养基内氰化钾浓度降低，不能抑氰酸逸出，致使培养基内氰化钾浓度降低，不能抑制细菌生长制细菌生长 ，造成假阳性。，造成假阳性。l 氰化钾为剧毒品，操作时须谨慎，用后培养基每氰化钾为剧毒品，操作时须谨慎，用后培养基每管加数粒硫酸亚铁和管加数粒硫酸亚铁和20%氢氧化钾氢氧化钾0.5ml去毒，然后去毒，然后再灭菌、洗涤。再灭菌、洗涤。2022-4-2436铜绿假单胞菌检验程序铜绿假单胞菌检验程序 l 供试品供试品 供试液供试液l l BL增菌液增菌液 l

23、35371824h l 溴代十六烷三甲胺平板溴代十六烷三甲胺平板 35371824h l 氧化酶、革兰染色镜检氧化酶、革兰染色镜检l l l 氧化酶阴性氧化酶阴性 氧化酶阳性氧化酶阳性l 非革兰阴性无芽孢杆菌非革兰阴性无芽孢杆菌 革兰阴性无芽孢杆菌革兰阴性无芽孢杆菌 l l 绿脓菌素绿脓菌素l 报告报告 l 绿脓菌素阳性绿脓菌素阳性 绿脓菌素阴性绿脓菌素阴性 l l 生化试验生化试验 l 报告报告2022-4-2437注意事项注意事项 l铜绿假单胞菌污染药品后，因生产工艺和药物的铜绿假单胞菌污染药品后，因生产工艺和药物的影响，在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形态影响，在溴代十六烷基三甲胺平板上

24、的菌落形态可产生非典型形态。为防止漏检，在挑取疑似菌可产生非典型形态。为防止漏检，在挑取疑似菌落时，宜取落时，宜取23个以上菌落，分别进行检验，以提个以上菌落，分别进行检验，以提高铜绿假单胞菌的检出率。高铜绿假单胞菌的检出率。l做氧化酶试验时，试验菌苔必须新鲜，陈旧培养做氧化酶试验时，试验菌苔必须新鲜，陈旧培养物反应不可靠物反应不可靠l试验应避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接试验应避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接种针（环）（白金材料除外），挑取菌苔，否则种针（环）（白金材料除外），挑取菌苔，否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒。易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒。2022-4-2438注意事项

25、注意事项l试剂试剂 宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯二宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用。胺氧化变色不可用。l该反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以该反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸没培养物，使之与空气隔绝，造成假阴性反应。免浸没培养物，使之与空气隔绝，造成假阴性反应。l绿脓菌素是铜绿假单胞菌鉴定的重要特征，但色素绿脓菌素是铜绿假单胞菌鉴定的重要特征，但色素的产生受许多因素的影响，除菌株差异及变异外，的产生受许多因素的影响，除菌株差异及变异外，培养条件是重要因素，温度、培养基成分等皆可影培养条件是重要因素，温度、培养基成分等皆可影响色素产生。培养

26、基中琼脂、蛋白胨等均应事先测响色素产生。培养基中琼脂、蛋白胨等均应事先测试，选用适宜品牌，实验时并用阳性菌株作对照试试，选用适宜品牌，实验时并用阳性菌株作对照试验。验。2022-4-2439金黄色葡萄球菌检验程序金黄色葡萄球菌检验程序l 供试品 供试液l l 营养肉汤（亚碲酸钠肉汤） l 35371824h l 卵黄氯化钠平板或甘露醇氯化钠平板 35371824h l l 无菌落 营养琼脂斜面 l 35371824h l 报告 血浆凝固酶试验，革兰染色镜检2022-4-2440注意事项注意事项 l金黄色葡萄球菌在上述三种分离培养基上的典型菌落为金黄色。但由于受药物影响或非典型菌株存在，可呈橙黄

27、色、柠檬色或白色。做控制菌检查，对非典型菌落也有必要进行凝固酶试验做金黄色葡萄球菌的筛查，以防漏检金黄色葡萄球菌。培养基存放时间和培养时间影响色素产生，故培养基应新鲜配制。培养时间宜48h以上。 l做血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新鲜血浆。如用旧培养物及血浆易导致假阴性反应。此外，观察结果时不宜摇动试管，因凝固初期凝块不结实易破坏，引起假阴性反应。 2022-4-2441梭菌的检验程序梭菌的检验程序l 供试液10ml 2份（1份置80水浴保温10分）l l 100ml疱肉培养基 l 厌氧培养7296h l 未浑浊、产气、消化碎肉、臭气 0.2ml l l 报告 含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板l 厌氧培养 4872hl l 无菌生长 过氧化氢酶试验l l 报告 过氧化氢酶阴性、G+梭 l 菌有或无卵圆形或球形芽孢l l 报告，检出梭菌 2022-4-2442注意事项注意事项 厌氧培养 是厌氧菌培养的基本前提，有些厌氧菌严格厌氧，一旦在有氧