第6章工业微生物菌种的扩大培养

1、第六章第六章 工业种子的扩大培养工业种子的扩大培养 讲授内容：讲授内容：n第一节 概述n第二节 种子制备的过程n第三节 种子质量的控制【教学目的与要求教学目的与要求】了解种子制备过程中的相关术语、掌握各种种子制备的方法及影响种子质量的因素和控制。【教学重点与难点教学重点与难点】种子制备的方法及影响种子质量的因素和控制。思考题：思考题：1、简述种子制备的工艺流程简述种子制备的工艺流程2、怎样确定种子罐的级数？3、作为种子应具备那些条件？作为种子应具备那些条件？4、简述影响种子质量的因素及控制。5、概念：接种量、种子制备、种子罐的级数、发接种量、种子制备、种子罐的级数、发酵罐的级数、种龄、孢子制备

2、。酵罐的级数、种龄、孢子制备。6、种子异常情况分析。 第一节 概述 定义：定义：由保藏的菌种开始，经过逐级扩大培养后，最后获得供生产车间生产的，足够数量和优质质量的纯种。纯种培养物称为种子。种子的扩大培养过程又称种子制备。n菌种扩大培养的目的： 1.提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种； 目的就是：a、缩短发酵周期，降低能耗、减少染菌的机会（空气过滤设备有效时间是有限的） b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑制杂菌的生长。2.让菌种从固试管、液体试管，逐步适应； 如：啤酒酵母 3.菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减少“倒罐”现象。 作为种子必备的条件作为种子必备的条件：1.生命旺

3、盛有活力，移种后，能迅速生长，缩短延滞期。2.菌体总量适宜，保证发酵罐的接种量。3.遗传表现性要稳定；4.菌种要纯。无杂菌污染。5. 保持稳定的生产能力。概念：概念：种子罐的级数：种子在种子罐中扩大培养的次数。发酵罐的级数：种子罐数加一。接种量：是指移入的种子液体体积和接种后培养液体积的比例。 或移入的种子液体积占接种前培养液体积的百分数。种龄：生产种子时的培养时间。孢子制备：用固体培养的种子叫孢子制备。种子制备：用液体培养的种子叫种子制备。 第二节 种子制备的过程 一.种子制备的一般流程 二.孢子的制备 三.种子的制备保存斜面沙土管冷干管液氮管一级斜面二级斜面米孢子母瓶（摇瓶）子瓶（摇瓶）一

4、级种子罐二级种子罐三级种子罐发酵罐实验室种子制备实验室种子制备菌种保存菌种保存生产种子制备生产种子制备一、种子制备的一般流程n确定流程的原则：确定流程的原则： 1、保证发酵罐的菌种量； 2、尽量缩短流程、以防治染菌。n考虑因素：考虑因素： 1、发酵罐的体积 2、菌种的特性 3、工艺上菌种量的要求扩大培养的方法通常有两种方法：固体法：用于酿造业（酱油、白酒等），也是源于酿造业， 有霉菌的纯培养，也有混合培养如：大曲液体法：液体深层培养，适合于众多发酵行业 液体培养为主导方式。 n随着生物工程与技术的发展，许多传统的应用微生物工业的菌种已形成了产业化。例如：酒精的生产 原生产工艺流程为： 以酵母为

5、线条的生产工艺为： 以霉菌为线条的生产工艺为：n现在：（1）酵母使用粉末酵母 鲜压榨酵母 固定化酵母细胞 （2）霉菌则由各种液化、糖化酶取代 二、固体培养孢子制备（一）斜面孢子的制备（二）米粒孢子（三）种曲（一）斜面孢子的制备 在试管或扁瓶（茄子瓶）内，以琼脂固化的培养基表面生长的菌种培养物。斜面种子制备流程： 培养基 分装 灭菌冷却摆斜面接种培养斜面种子制备中应注意的问题：制备中应注意的问题：1、琼脂的用量、琼脂的用量 2、不含有沉淀的固体物，、不含有沉淀的固体物，用蒸馏水或去离子水。用蒸馏水或去离子水。 3、装量、装量 4、减少冷凝水、减少冷凝水 5、微量元素先配成一定、微量元素先配成一定

6、的，用移液管定量加入。的，用移液管定量加入。影响斜面种子质量的因素影响斜面种子质量的因素：1、原材料的质量；2、灭菌条件；3、接种量；4、培养条件；5、培养时间；6、有害气体和挥发物；7、冷藏时间。（二）米粒孢子（米孢子） 米孢子：霉菌的孢子培养，接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一段时间后所产生的孢子。优点：保存期较长，可用半年以上。 孢子量大，107-108个孢子/g米粒。质量标准： 1.无杂菌污染，每500瓶抽样检查1-2瓶； 2.足够孢子数，发芽率80%； 3.生产能力高； 4.真空干燥后含水率小于8%；大米或小米大米或小米水洗浸泡水洗浸泡沥干沥干分装分装混匀混匀灭菌灭菌接种接种

7、（摇匀）（摇匀）培养培养米孢子米孢子制备工艺流程制备工艺流程：斜放，且摇翻动斜放，且摇翻动注意事项注意事项：1、浸泡时间及加营养液、浸泡时间及加营养液的量应掌握在灭菌后米的量应掌握在灭菌后米粒熟透而不粘连。粒熟透而不粘连。2、分装量、分装量2-3厘米厚度厘米厚度3、米粒不要碰在瓶口、米粒不要碰在瓶口4、前期摇动，后期不要、前期摇动，后期不要再动再动5、米粒可存放半年，冰、米粒可存放半年，冰箱箱4、真空干燥蜡封。、真空干燥蜡封。无菌蒸馏水无菌蒸馏水斜面孢子斜面孢子孢子悬浮液孢子悬浮液（三）种曲（三）种曲 培养材料用麸皮、米糠、稻壳等 柠檬酸、酱油、醋放线菌孢子的制备放线菌孢子的制备：琼脂斜面培养

8、基，碳源和氮源不要太丰富，干燥和限制营养可诱发孢子形成。培养温度28 ，少数37 ；培养时间5-14天。霉菌孢子的制备霉菌孢子的制备：一般采用米孢子或种曲，培养温度25 -28 ，培养时间4-14天。细菌孢子的制备细菌孢子的制备：琼脂斜面培养基，碳源限量氮源丰富配方，牛肉膏、蛋白胨。温度37 ，少数28 ；培养时间一般1-2天，产芽孢的细菌5-10天。n三、种子的制备（一）摇瓶种子制备摇瓶种子制备（二）种子罐的种子培养种子罐的种子培养 种子制备种子制备:将固体培养的孢子或菌丝转到液体培养基中培养，使其产生大量的菌丝或菌体的过程。（一）摇瓶种子制备1、摇瓶种子：、摇瓶种子： 将斜面种子、米孢子、

9、种曲接种于锥形瓶内液体培养基中，摇床上震荡培养得到的液体种子。2、制备流程、制备流程 培养基配制分装灭菌冷却接种 震荡培养摇瓶种子。3、制备过程中注意事项：、制备过程中注意事项：营养比斜面要丰富，保持pH稳定装量要适当，保持良好的通气；好氧培养三角瓶 40-50mL/250mL、 6080mL/500mL、 90-110mL/750mL、120-150mL/1000mL。 厌氧培养时装液量增加一倍。灭菌时要注意棉塞不要被打湿。摇床转速。注意摇床上下、边缘、中心的温差。4、质量检查、质量检查菌体浓度：外观稠度、静止沉降率、离心沉降率。菌丝的生长阶段：对数期后期。代谢情况：生产能力：摇瓶发酵实验。

10、（二）种子罐的种子培养（二）种子罐的种子培养孢子或摇瓶菌丝一级种子罐二级发酵发酵罐二级种子罐三级发酵发酵罐四级发酵发酵罐三级种子罐种子罐级数的确定：1、菌种的体积 2、孢子发芽能力 3、发酵罐的体积种子进入发酵罐：能迅种子进入发酵罐：能迅速生长，达到一定的量，速生长，达到一定的量，利于产物合成。利于产物合成。1、生产流程：、生产流程：n 培养基配制培养基配制灭菌（培养基及种子罐）灭菌（培养基及种子罐） 冷却冷却接种接种一级培养一级培养二级培养二级培养接入发酵罐接入发酵罐2、制备过程注意事项：、制备过程注意事项：n培养基要求与发酵培养基相同培养基要求与发酵培养基相同n接种方式接种方式：a、火圈保

11、护法、火圈保护法 b、压差法、压差法n接种时通入的空气温度要适中接种时通入的空气温度要适中npH要合理要合理n控制合适的接种量控制合适的接种量第三节第三节 种子质量的控制种子质量的控制一、影响孢子质量的因素及控制n1、培养基 原材料产地、品种、加工方法如：蛋白胨、琼脂；水质等n2、培养的温度和湿度 龟裂链霉菌（土霉素）36.5-37 36.5 3天+28.5 1天，产量比36.5 4天 高3-7倍 湿度40-45%(北方)，35-42%(南方)。n3、培养的时间 A、孢子发芽和基质菌丝生长阶段 B、气生菌丝生长阶段 C、孢子形成阶段 D、孢子成熟阶段：显微镜下可看到成串的孢、孢子成熟阶段：显微

12、镜下可看到成串的孢子，或游离的分散孢子。子，或游离的分散孢子。 E、衰老菌丝自溶阶段：白色斑点、发黑。n4、pH 二、影响种子质量的因素及控制二、影响种子质量的因素及控制n1、培养基：逐步接近发酵培养基n2、培养条件：温度、溶氧n3、种龄：对数生长期的菌丝 细菌 霉菌 放线菌 7-24h 16-50h 21-64h.n4、接种量；霉菌的发酵10%；抗生素7-15%；制霉菌素0.1-1%好于10%。n5.pH值 菌种扩大培养的pH值很重要，影响到菌体的正常生长，需要注意以下两点：（1）扩培选择的pH值是菌体的最适生长pH值，往往与发酵最适pH值不同。（2）培养基灭菌后，通常其pH值要下降0.51.0个单位，因此，（三角瓶灭菌后，不能够调整pH值，不宜无菌操作） 三、种子质量的标准三、种子质量的标准n1、细胞或菌丝：单细胞菌体菌体健壮、菌形一致，均匀整齐，还要有一定的排列和形态。霉菌和放线菌菌丝粗壮，分枝情况、内含物情况良