real-timePCR

1、Real-time PCR曹达江荧光定量荧光定量PCR定义及数学原理定义及数学原理荧光定量荧光定量PCR的两种主要标记方法（化学原理）的两种主要标记方法（化学原理）荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法定量定量PCR注意事项及常见问题注意事项及常见问题荧光定量荧光定量PCR定义及数学原理定义及数学原理荧光定量荧光定量PCR的两种主要标记方法（化学原理）的两种主要标记方法（化学原理）荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法定量定量PCR注意事项及常见问题注意事项及常见问题PCR 反应过程5533d.NTPsTaq 酶Primers5353535353535353反应组分反应组分变变 性性53535

2、3535353延延 伸伸53535353353TaqTaq55重重 复复退退 火火5353535355335353循环循环2 24 4个拷贝个拷贝循环循环3 38 8个拷贝个拷贝53535353535353535353533553535353Cycle #TheoreticalReal LifeLog Target DNAPCR反应模式 020040060080010001200024681012拷贝数循环数拷贝数拷贝数CDNA=2cycle实时定量实时定量PCR技术：技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与

3、常规与常规 PCR技术比较：技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测几个关键名词几个关键名词u阈值阈值uCt值值u扩增曲线扩增曲线荧光阈值荧光阈值l 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。l 荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（仪器自动设置）（BIO-RAD 210循环）l 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段l 真正的信号:荧光信号超过阈值基线：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧

4、光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。Ct值值PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）扩增曲线扩增曲线Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLgliner phase平台期平台期定量定量PCR的数学原理的数学原理理想的理想的PCRPCR反应：反应：X Xn n=X=X0 02 2n n实际的实际的PCRPCR反应：反应：X Xn n=X=X0 0(1+Ex)(1+Ex)n n方程式两边同时取对数得方程式两边同时取对数得: : log Xn=log (X0 (

5、1+Ex)n)整理方程式得整理方程式得: :log X0= (- log(1+Ex) )n+ log Xn将将C(t)C(t)和达到和达到C(t)C(t)值时终产物的量值时终产物的量Xc(t)带入上式得：带入上式得：log X0= (- log(1+Ex) ) C(t)+ log Xc(t) （y= -kx+b） 初始浓度的对数与循环数呈线性关系初始浓度的对数与循环数呈线性关系X X为产物浓度，为产物浓度，X X0 0表示初始模表示初始模板浓度，板浓度，n n表示循环次数表示循环次数Cycle numberCk 104Ck 102SampleLg of DNA concentration模板D

6、NA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。CtCt值与模板起始量的关系值与模板起始量的关系荧光定量荧光定量PCR定义及数学原理定义及数学原理荧光定量荧光定量PCR的两种主要标记方法（化学原理）的两种主要标记方法（化学原理）荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法定量定量PCR注意事项及常见问题注意事项及常见问题荧光定量荧光定量PCR的两种主要标记方法的两种主要标记方法(化学原理化学原理)非特异性荧光标记（染料法）非特异性荧光标记（染料法） SYBR Green I特异性荧光标记特异性荧光标记 TaqMan ProbeSYBR Green ISYBR

7、 Green I染料法染料法原理原理 SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。最大激发波长454nm。荧光分子吸收了激发光光子的能量之后,外层电子跃迁到能级比较高的状态,再由能级比较高的状态回到能级比较低的状态时会释放出荧光.SYBR GREEN结合

8、DNA之后,电子云发生了改变,使得电子的能级状态发生了改变.我们知道电子能级的跃迁是量子化的,结合DNA之前,电子从基态到激发态的能量不等于激发光光子的能量,所以不能吸收光子,也不会产生荧光.结合之后,电子从基态到激发态的能量等于激发光光子的能量,所以能吸收光子,并被激发到激发态,然后再回到能级低的状态,发出荧光.SYBR Green I SYBR Green I 染料法染料法作用机理作用机理问题点：问题点： SYBR Green I与双链与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的

9、产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法问题点与关键点问题点与关键点关键点：关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！设计合适引物，防止非特异性扩增！原始图谱原始图谱对数图谱对数图谱SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法融解曲线融解曲线溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物,包括非特异性产物.扩增反应完成后,通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线,随着反应中双链DNA变性,荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低,用荧光信号改变的负的一次导数与温

10、度作图,在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm,DNA双链解链50的温度）,用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开,因为它们在不同的温度溶解.这个一般是用SYBY Green作为荧光染料的时候需要做的工作!因为SYBY Green染料是非特异的染料,只要有扩增,染料就可以镶嵌在双链中发出荧光.我们做溶解曲线是为了观察我们扩增发出荧光的片段是不是我们需要的产物.如果溶解曲线做出来只有单峰,且出锋位置是你的退火温度,那么这个是你的产物发出的荧光,实验结果有效.如果出现多峰或退火温度不对,那么这个实验结果是不可信的!需要再次调整!融解曲线分析，单一峰融解曲线分析，单一峰无非特异性荧

11、光无非特异性荧光定量准确定量准确融解曲线分析，出现杂峰融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确光，因此定量不准确SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法融解曲线融解曲线 使用方便，不必设计复杂探针使用方便，不必设计复杂探针 具有价格优势具有价格优势 适用于高通量大规模的定量适用于高通量大规模的定量PCR检测以及专一性要求不高的定量检测以及专一性要求不高的定量PCR检测。检测。优优 点点 无模板特异性无模板特异性 对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高 不能进行多重定量不能进行多重定量 灵敏度相对较低灵敏度相对较低缺缺 点点SYB

12、R Green ISYBR Green I染料法染料法优缺点优缺点TaqmanTaqman探针法探针法原理原理u5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 u 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)u 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光u Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法是高度特异的PCR技术，其核心是利用Taq酶的3-5外切酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板是特异性结合的，所以荧光信号的强弱，代表了模板的数量。多重Taqman荧光定量PCR在报告基团的选择中不同探针不能选择相同或者

13、相近波长报告基团ABI7500检测光谱通道TaqmanTaqman探针法探针法工作机理工作机理 高度特异性高度特异性 重复性好重复性好 灵敏度高灵敏度高 可进行多重定量可进行多重定量优优 点点 只适合一个特定的目标只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针不易找到本底低的探针缺缺 点点TaqmanTaqman探针法探针法优缺点优缺点方法方法优点优点缺点缺点SYBR Green I 方法引物价格低廉，不需要进行特殊处理，适用性广灵敏度高引物要求高，非特异扩增或者是引物二聚体影响结果。一个反应只能对一个基因进行检测TaqMan 方法重复性好特异性高可进

14、行多重PCR引物二聚体不影响结果探针合成价格高昂，且必须找专业公司合成两种方法的对比两种方法的对比荧光定量荧光定量PCR定义及数学原理定义及数学原理荧光定量荧光定量PCR的两种主要标记方法（化学原理）的两种主要标记方法（化学原理）荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法定量定量PCR注意事项及常见问题注意事项及常见问题绝对定量(Absolute Quantification，AQ)相对定量(Relative Quantification，RQ) 绝对定量与相对定量的定义绝对定量与相对定量的定义绝对定量通过标准品定量绝对定量通过标准品定量绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标

15、准样品的种类：含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNAPCR的产物绝对定量：从荧光到拷贝数绝对定量：从荧光到拷贝数标准曲线评价标准曲线评价评价标准曲线： 扩增效率(E) -90%-110% 相关系数(R2) -大于0.98 平行管重复性 -SD小于0.167 扩增效率扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为：扩增效率（E）10-1/斜率。理论上，在每个指数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产物2倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2，就可得210-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32，斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。如果将扩增效率用百分率来表示，即：E%=

16、(E-1)100%，对于理想的PCR反应，E=2，即：扩增效率E%=(2-1)100%=100% 如果E1.92，带入方程(1.92-1)100%=92%，表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增加1.92倍，或每次循环有92的模板被扩增。一般说来，扩增效率接近100是优化的重复性好实验的最好标志，实际操作时，反应的扩增效率应该在90110之间，如果扩增效率低，可能的原因是引物设计不当，或者反应条件未优化；扩增效率大于100时，可能的原因是系列稀释样品加样错误，或者有非特异性产物扩增，如引物二聚体产生。用上述方法确定扩增效率时，反应体系中的抑制剂的出现也可能导致扩增效率明显增加，原因是高浓度模板

17、样本中抑制剂的浓度低，导致反应的Ct值延迟出现，而低浓度模板样本中抑制剂浓度高，反应的Ct值延迟程度小，导致斜率的绝对值以及计算所得的扩增效率会增加。如果扩增效率小于90或大于105，建议重新设计引物或探针。相对相对定量：定量：处理前后基因相比变化了多少处理前后基因相比变化了多少示例移植前移植后移植后患者自身的HLA基因的水平有什么变化？相对定量通过内标定量相对定量通过内标定量内标（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量Actin即“肌动蛋白”，是细

18、胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括-skeletal muscle actin，-cardiac muscle actin，-smooth muscle actin，和-smooth muscle actin； 其余两种广泛分布于各种组织中，包括-actin(-non-muscle)和-non-muscle actin。不同的actin之间同源性大于90%，GAPDH基因结构GAPDH或G3P

19、DH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）的英文缩写 该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个3040kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。移植前移植后加入一个内标基因移植前移植后两种相对定量的方法两种相对定量的方法Ct发双标准曲

20、线法确认样本间的倍数关系如何选择相对定量的方法？如何选择相对定量的方法目的基因内参基因Ct浓度A1B1BC1CD1DE1EF1FG1GACt1=A-A1Ct2=B-B1Ct1=C-C1Ct1=D-D1Ct1=E-E1Ct1=F-F1Ct1=E-E1将相同浓度下Ct值相减Ct1=A-A1Ct2=B-B1Ct1=C-C1Ct1=D-D1Ct1=E-E1Ct1=F-F1Ct1=E-E1利用Ct作图Ct1Ct1Ct1Ct1Ct1Ct1Ct1|斜率|0.1 Ct 法|斜率|0.1 双标注曲线法相对定量分析方法相对定量分析方法1 -Ct1 -Ct前提：目标序列和内参序列有相一致的扩增效率（偏差在 5以内）

21、且接近100 1、内参基因均一化样本： CT（未处理样本）= CT （目的基因) - CT （内参基因） CT（处理样本)= CT （处理样本目的基因) - CT （处理样本内参基因) 2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值： CT= CT（处理样本) - CT（未处理样本) 3、计算表达水平比率： 2 CT=表达量的比值移植天数移植天数Ct目标基因目标基因Ct GAPDHCtCt患者本身患者本身HLA基因含量基因含量供者供者HLA基因含量基因含量移植前231310移植后1天2414100100%0%移植后5天28141446.25%93.75%移植后15天341420100.0976%9

22、9.9024%以前面移植为例，在增加第5天和第15天的检测，如下表：相对定量分析方法相对定量分析方法2 2：双标准曲线法：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同目标基因与内参基因扩增效率不同 用目标基因和内标基因的标准品分别获得用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线标准曲线 处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)C(t)值值 用内标基因对目标基因用内标基因对目标基因均一化均一化 处理样本与未处理样本目标基因处理样本与未处理样本目标基因C(t)C(t)值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本值经内参基因均一

23、化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异的表达差异绝对定量绝对定量相当定量对比相当定量对比荧光定量荧光定量PCR定义及数学原理定义及数学原理荧光定量荧光定量PCR的两种主要标记方法（化学原理）的两种主要标记方法（化学原理）荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法定量定量PCR注意事项及常见问题注意事项及常见问题无Ct值（信号）出现或出现过晚：阴性对照出现明显的扩增：荧光PCR mix或水污染；出现引物二聚体：设计特异性引物。反应循环数不够；检测荧光信号步骤有误；引物、探针设计不佳或降解；模板量少或降解。反应条件或体系不佳：优化；扩增片段过长：100200bp。正常扩增曲线异常扩增曲线没有平台期平台期低扩增荧光值很低，扩增曲线没有指数期，PCR扩增效率比较低。扩增效率低可能跟u模板质量低，看是不是提取的模板里含有PCR抑制物。u还可能是是引物设计得不好，