第四章沉淀法

1、第四章第四章 沉沉 淀淀 法法 (precipitation)(precipitation)生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程原料液原料液细胞分离细胞分离( (离心，过滤离心，过滤) )细胞胞内产物细胞胞内产物路线一路线一路线二路线二细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离路线一路线一A A路线一路线一B B清液胞外产物清液胞外产物粗分离粗分离( (沉淀沉淀/ /超过滤超过滤/ /萃取萃取) )纯化纯化( (层析、离子交换、吸附层析、离子交换、吸附) )脱盐脱盐( (凝胶过滤、超滤凝胶过滤、超滤) )浓缩浓缩( (超滤超滤) )精制精制( (结晶、干燥结晶、干燥) )包含体包含体溶解溶解(

2、(加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲) )复性复性沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。而形成无定形固体沉淀的过程。沉淀法的目的：沉淀法的目的：(通过沉淀达到浓缩的目的；通过沉淀达到浓缩的目的；(沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步纯化成分，初步纯化 ；(将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。步处理。沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在

3、工业上和实验室中。前仍广泛应用在工业上和实验室中。4.1 概述沉淀法的原理：沉淀法的原理：(生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。(沉淀法基本原理沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，离的目的，(溶剂组分的改

4、变或加入某些沉淀剂以及改变溶溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的液的pHpH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。度产生明显的改变。 概 述n沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。n操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小

5、时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：通常按三步进行： 概述概述沉淀法操作步骤沉淀法操作步骤：首先加入沉淀剂，首先加入沉淀剂，沉淀剂的陈化，促进粒子生长；沉淀剂的陈化，促进粒子生长；离心或过滤，收集沉淀物。离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响收率和沉淀物的形状都有很大影响。 概述概述沉淀生成动力学溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认稳定以后，分子互相

6、碰撞并产生聚并作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：为相互碰撞由下面几种运动引起：热运动，热运动，BromnianBromnian运动；运动；对流运动，由机械搅拌产生；对流运动，由机械搅拌产生；差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。为了简化沉淀过程动力学，为了简化沉淀过程动力学，可把沉淀过程分成下述个步骤：可把沉淀过程分成下述个步骤：n(1) (1) 初始混合初始混合n(2) (2) 新相生成新相生成n(3) (3) 布朗运动凝集布朗运动凝集n(4) (4) 机械碰撞凝集机械碰撞凝集n(5) (5) 聚集体陈化聚集体陈化n(6) (6) 聚集体沉淀

7、聚集体沉淀沉淀生成动力学沉淀生成动力学沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。时最常用的方法。l优点：操作简单、经济、浓缩倍数高优点：操作简单、经济、浓缩倍数高l缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强性不强概概 述述沉淀法的分类沉淀法的分类根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1 1

8、）盐析法；）盐析法；（2 2）等电点沉淀法；）等电点沉淀法；（3 3）有机溶剂沉淀法；）有机溶剂沉淀法；（4 4）非离子型聚合物沉淀法；）非离子型聚合物沉淀法；（5 5）聚电解质沉淀法；）聚电解质沉淀法；（6 6）复合盐沉淀法等）复合盐沉淀法等（7 7）亲和沉淀法）亲和沉淀法（8 8）选择性沉淀法。）选择性沉淀法。 蛋白质的溶解特性蛋白质的溶解特性n蛋白质是两性高分子电解质（蛋白质是两性高分子电解质（amphoteric amphoteric polymerpolymer），主要由疏水性各不相同的），主要由疏水性各不相同的2020种氨基酸种氨基酸组成。组成。n在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸

9、残基具有在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏向内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。强。n亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。外表面。n因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成荷电区、亲水区和疏水区构成。蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域蛋白质分子表面

10、的憎水区域和荷电区域蛋白质的溶解特性蛋白质的溶解特性n蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及分子周蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及分子周围溶液性质所决定。围溶液性质所决定。n蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。n一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。大分子蛋白质更易溶解。防止蛋白质凝聚沉淀的屏障防止蛋白质凝聚沉淀的屏障u蛋白质周围的水化层蛋白质周围的水化层（hydration shell)，保保护了蛋白质粒子，避免

11、了相互碰撞，护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质使蛋白质形成稳定的胶体溶液。形成稳定的胶体溶液。u蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。（存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电（存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。离子的电荷构成双电层。4.4.盐析盐析盐析盐析概念：概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的

12、溶解度降低，产生沉生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。淀的过程。盐析是可逆的，而变性是不可逆的盐析是可逆的，而变性是不可逆的早在早在18591859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。级中使用，得到了比较满意的结果。 盐析法机理盐析法机理（1 1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分

13、子周围的水化膜层减弱乃至消失，力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2 2）破坏水化膜，暴露出憎水区域破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。易沉淀。（3 3）中和电荷，减少静电斥力中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。沉

14、淀。盐析过程盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：种情况：（1）“盐溶盐溶”现象现象(salt-in)低盐浓度下，增加蛋低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。（2）“盐析盐析”现象现象(salt-out)高盐浓度下，中和高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降 。l盐析作用要强盐析作用要强l盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐需有较大的溶解度l盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的l来源丰富、经济来源丰富、经济1）盐析用盐的选

15、择）盐析用盐的选择盐析用盐的选择盐析用盐的选择在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱用较强，半径大的低价离子作用较弱阴离子盐析效果阴离子盐析效果 ：柠檬酸柠檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-SCN-阳离子盐析效果：阳离子盐析效果：NH4+ K+Na+ 高价阳离子高价阳离子阴离子的影响大于阳离子阴离子的影响大于阳离子盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠盐析中常用的盐：硫酸铵、硫

16、酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂u（1 1）价廉；）价廉；u（2 2）溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；）溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；u（3 3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，u（4 4）不易引起蛋白质变性。）不易引起蛋白质变性。 盐析用盐的选择盐析用盐的选择缺点：缺点：（1）水解变酸；）水解变酸；（2）高）高pH 释氨，腐蚀；释氨，腐蚀；（3）残留产品有影响。）残留产品有影响。盐析操作(加盐方式）硫酸铵的加入有以下几种方法：硫酸铵的加入有以下几种方法：1 1）加入固体盐法）加

17、入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入。况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入。搅拌可加速溶解和胶体溶液的破坏，有利于蛋白质的沉淀，但搅拌可加速溶解和胶体溶液的破坏，有利于蛋白质的沉淀，但强烈搅拌会产生泡沫。引起蛋白质表面变性或活力下降，并会强烈搅拌会产生泡沫。引起蛋白质表面变性或活力下降，并会使沉淀破碎，形成细小颗粒，沉淀不完全，增加过滤的困难。使沉淀破碎，形成细小颗粒，沉淀不完全，增加过滤的困难。所以搅拌需适中。所以搅拌需适中。2 2）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法 用于

18、要求饱和度不高而原来溶液体积不大用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3 3）透析平衡法）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。u一般说来，离子强度越大，蛋

19、白质的溶解度越一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。低。u在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。子强度顺次进行。u每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。使另一种蛋白质组分盐析出来。 u组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。沉淀。2 2）盐浓度对盐析效果的影响

20、）盐浓度对盐析效果的影响 S=-S=-s sS S蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度，g/L; g/L; I I离子强度，离子强度， I=1/2mI=1/2mi iz zi i2 2 m mi i离子离子i i的摩尔浓度；的摩尔浓度；ZiZi所带电荷所带电荷常数，图中常数，图中截距截距KsKs盐析常数，图中直线斜率盐析常数，图中直线斜率CohnCohn经验式经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系蛋白质溶解度与盐浓度的关系和和Ks的物理意义的物理意义n代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温

21、度、pHpH值有值有关，与盐无关；关，与盐无关；nKsKs盐析常数，代表图中直线的斜率；盐析常数，代表图中直线的斜率；n从一些实验结果表明，从一些实验结果表明，KsKs与温度和与温度和pHpH无关，但和蛋白无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，酸铵作为沉淀剂时，KsKs值对不同的蛋白质来说，其变值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过化不会超过1 1倍。倍。用盐析法分离蛋白质的二种方法用盐析法分离蛋白质的二种方法盐析法分为两类，盐析法分为两类，第一类叫第一类叫Ks分段盐析法，分段盐析法，在一定在一定pH和温度下通

22、和温度下通过改变离子强度实现，过改变离子强度实现，（固定固定pH, 温度，温度，改变盐改变盐浓度浓度），），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液；用于早期的粗提液；第二种叫第二种叫分段盐析法，分段盐析法，在一定离子强度下通过在一定离子强度下通过改变改变PH和温度来实现，（固定离子强度，和温度来实现，（固定离子强度，改变改变pH及温度及温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶。离纯化和结

23、晶。盐析用盐量的确定盐析用盐量的确定- -饱和度：饱和度：u饱和度（饱和度（Saturation）的概念：）的概念： 以硫酸铵为例：以硫酸铵为例：250C时，硫酸铵的饱和溶解度时，硫酸铵的饱和溶解度是是767g/L定义为定义为100%饱和度饱和度u目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。u对多数蛋白质，当达到对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度饱和度时，溶解度都小于都小于 0.l mg/L，通常为兼顾收率与纯度，饱，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在和度的操作范围在40%-60%

24、之间。之间。原蛋白溶液体积为原蛋白溶液体积为V，欲使其硫铵饱和度达到，欲使其硫铵饱和度达到S，需加入饱和硫酸铵溶液的体积数？需加入饱和硫酸铵溶液的体积数？ X=VS/(1-S) X：应加入的饱和硫铵溶液的体积：应加入的饱和硫铵溶液的体积 V：原蛋白质的溶液的体积：原蛋白质的溶液的体积 S：应达到的硫铵饱和度：应达到的硫铵饱和度原来蛋白溶液的饱和度为原来蛋白溶液的饱和度为S1，现希望其饱和度增加，现希望其饱和度增加为为S2，需加入多少体积的饱和硫酸铵溶液，需加入多少体积的饱和硫酸铵溶液? X=V (S2- S1)/(1-S2) X：应加入的饱和硫铵体积：应加入的饱和硫铵体积 V：原有溶液的体积：

25、原有溶液的体积 S ：原溶液硫铵的饱和度：原溶液硫铵的饱和度 S ：要达到的硫铵的饱和度：要达到的硫铵的饱和度加固体硫铵的方法加固体硫铵的方法考虑到在盐析时，如加饱和硫铵溶液会使考虑到在盐析时，如加饱和硫铵溶液会使溶液体溶液体积增大或使蛋白质浓度降低积增大或使蛋白质浓度降低，因此加入固体硫铵，因此加入固体硫铵比较适合，可用公式计算。比较适合，可用公式计算。在在20 时使时使1L M1摩尔浓度时（摩尔浓度时（NH4）2SO4溶液增溶液增至至M2摩尔浓度，所需加入（摩尔浓度，所需加入（NH4）2SO4的克数的克数C： C =533（M -M ）/(4.05-0.3M2) C：需加硫铵的g数 M1：

26、原溶液的浓度摩尔数 M2：需达到的浓度摩尔数在在20 时使时使1升升S1饱和度时（饱和度时（NH4）2SO4溶液增溶液增至至S2饱和度，所需加入（饱和度，所需加入（NH4）2SO4的克数：的克数：C =533（S2-S1）/(100-0.3S2) C：需加硫铵的g数 S1：原溶液的饱和度 S2：需达到的饱和度以上数据都可在有关书上查到以上数据都可在有关书上查到 204060800100总蛋白总蛋白目标蛋白质目标蛋白质上清液蛋白浓度上清液蛋白浓度l由于不同的蛋白质溶解度由于不同的蛋白质溶解度不同，沉淀时所需的离子不同，沉淀时所需的离子强度也不相同，强度也不相同，l如果需要先除去些杂蛋白，如果需要

27、先除去些杂蛋白，然后在较高的饱和度下，然后在较高的饱和度下，沉淀目标蛋白质，则可采沉淀目标蛋白质，则可采用分段盐析用分段盐析改变盐的浓度，可将混合改变盐的浓度，可将混合液中的蛋白质分批盐析分液中的蛋白质分批盐析分开。开。l如半饱和硫酸铵可沉淀血如半饱和硫酸铵可沉淀血浆球蛋白，饱和硫酸铵则浆球蛋白，饱和硫酸铵则可沉淀包括血浆清蛋白。可沉淀包括血浆清蛋白。 分段盐析(fractional salting out)盐析的影响因素：3）pH值u一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋

28、白质溶解度最小。度最小。u为提高盐析效率，多将溶液为提高盐析效率，多将溶液pHpH值调到目的蛋白的值调到目的蛋白的等电点处。等电点处。 u注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液溶液pHpH值，以达到最好的盐析效果。值，以达到最好的盐析效果。在进行盐析时，必在进行盐析时，必须控制须控制pHpH图中直线都相互平图中直线都相互平行行pH值盐析影响因素：4）温度的影响u在低离子强度或纯水中，蛋白在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度质溶解度在一定范围内随温

29、度增加而增加。增加而增加。u但在高浓度下，蛋白质、酶和但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。升而下降。u在一般情况下，蛋白质对盐析在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在感的酶要求在0-40-4进行。进行。u随温度升高减小，热促失水随温度升高减小，热促失水膜膜uKsKs不随温度而变不随温度而变盐析的影响因素：5）蛋白质浓度 沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度有关。度有关。Z高浓度蛋

30、白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。Z在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。作用比较少，但回收率会降低。Z因此需要在两者之间进行适当选择。因此需要在两者之间进行适当选择。Z分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。Z一般认为一般认为2.

31、5%-3.0%2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于的蛋白质浓度比较适中。相当于25 25 mg/mLmg/mL30mg/mL30mg/mL。u对起始浓度为对起始浓度为 30g/L30g/L的的COMbCOMb溶液，大部分蛋白质在硫溶液，大部分蛋白质在硫酸铵饱和度为酸铵饱和度为 58-6558-65之间沉淀出来；之间沉淀出来；u但对稀释但对稀释1010倍的倍的 COMbCOMb溶液，饱和度达到溶液，饱和度达到66%66%时才开始时才开始沉淀，而相应的沉淀范围为沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%66-73%饱和度。饱和度。盐析注意事项盐析注意事项(选择适宜饱和度选择适宜饱和度(采用分步

32、盐析采用分步盐析(盐析的成败决定于溶液的盐析的成败决定于溶液的pHpH值与离子强度，稳定值与离子强度，稳定pHpH用磷酸缓用磷酸缓冲液冲液(在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。(盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。(为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测

33、酶活性。为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。(盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤一般可用超滤盐析注意事项盐析注意事项硫酸铵的使用硫酸铵的使用硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前用作用，使用前用H H2 2S S处理处理高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0PH=5.0左右），使用前左右），使用前也需要用氨水调节至所需也需要用氨水调节至所需PHPH。硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意硫酸铵容易吸潮

34、，计算饱和度需注意固体硫酸铵加入后体积变大固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化已考加入固体盐后体积的变化已考虑在表中；虑在表中；盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较低浓度硫酸铵溶液。的离心操作，耗时耗能。离心多用于较低浓度硫酸铵溶液。盐析法特点：盐析法特点：n成本低，不需要特别昂贵的设备。成

35、本低，不需要特别昂贵的设备。n操作简单、安全。操作简单、安全。n不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。到保持生物活性的纯化蛋白质。1.分离效果不理想，通常只是作为初步的分离分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。纯化，还需要结合其它的纯化方法。 4.等电点沉淀法等电点沉淀法 isoelectric point 等电点沉淀法等电点沉淀法在低的离子强度下，调在低的离子强度下，调pHpH至等电点，使蛋白质至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力了静电斥力，而疏水力能使

36、分子间相互吸引，能使分子间相互吸引，形成沉淀的操作称为等形成沉淀的操作称为等电点沉淀电点沉淀不同的两性电解质具有不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为不同的等电点，以此为基础可进行分离。基础可进行分离。生产胰岛素时，在粗提生产胰岛素时，在粗提液中先调液中先调pH8.0pH8.0去除碱性去除碱性蛋白质，再调蛋白质，再调pH3.0pH3.0去除去除酸性蛋白质。酸性蛋白质。pH=pIn蛋白质的离子化情况既与蛋白质的详细结构有关，也与蛋白质的离子化情况既与蛋白质的详细结构有关，也与溶液的溶液的pHpH值有关。一般来说，溶液的值有关。一般来说，溶液的pHpH值高，蛋白质带值高，蛋白质带负电；负电；pH

37、pH值低，蛋白质带正电。当溶液的值低，蛋白质带正电。当溶液的pHpH值为某一值值为某一值时，蛋白质几乎不带电，即时，蛋白质几乎不带电，即净电荷为零净电荷为零，或者说它带相，或者说它带相等的正电荷和负电荷，这时的等的正电荷和负电荷，这时的pHpH值称为等电点，常用值称为等电点，常用pIpI表示。表示。n两性电解质在溶液中两性电解质在溶液中pHpH处于等电点处于等电点pIpI时，分子表面静电时，分子表面静电荷为零，导致赖以稳定的荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜削弱或破坏双电层及水化膜削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低并沉淀析出。分子间引力增加，溶解度降低并沉淀析出。等电点沉淀法等电点沉淀法

38、等电点沉淀法操作十分简便，试剂消耗少，给体等电点沉淀法操作十分简便，试剂消耗少，给体系引入的外来物系引入的外来物( (杂质杂质) )也少。也少。是一种常用的分离是一种常用的分离纯化方法，纯化方法，收率低：收率低：但两性溶质（蛋白质）在等电点附近但两性溶质（蛋白质）在等电点附近（处）仍有一定的溶解度，（处）仍有一定的溶解度，( (有时甚至比较大有时甚至比较大) )，所以所以等电点沉淀往往不完全。等电点沉淀往往不完全。即等电点沉淀法往即等电点沉淀法往往不能获得高的回收率。往不能获得高的回收率。等电点沉淀的特点：等电点沉淀的特点：分辨率较低：许多分子的等电点比较接近，容易分辨率较低：许多分子的等电点

39、比较接近，容易发生共沉淀，所以分辨率较低。发生共沉淀，所以分辨率较低。因此很少单独使因此很少单独使用等电点沉淀法作为主要纯化手段，往往与盐析，用等电点沉淀法作为主要纯化手段，往往与盐析，有机溶剂沉淀等方法结合使用，在实际应用种主有机溶剂沉淀等方法结合使用，在实际应用种主要用于去杂蛋白。要用于去杂蛋白。n在蛋白质疏水性比较大和结合水比较小时的沉淀在蛋白质疏水性比较大和结合水比较小时的沉淀更有效。更有效。n最大缺点：最大缺点：无机酸有引起较大的蛋白质不可逆变无机酸有引起较大的蛋白质不可逆变性的危险。性的危险。 等电点沉淀注意事项等电点沉淀注意事项(1) 生物高分子的等电点易受盐离子的影响发生变化。

40、生物高分子的等电点易受盐离子的影响发生变化。 由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移漂移”，阳，阳-高，阴高，阴-低。即：若蛋白质分子结合低。即：若蛋白质分子结合多量阳离子如：如多量阳离子如：如Zn2+、Ca2+ 、Mg2+等，会造成等等，会造成等电点升高；若蛋白质分子结合多量阴离子如：如电点升高；若蛋白质分子结合多量阴离子如：如Cl-、SO42-、HPO42-等，则等电点降低。等，则等电点降低。n自然界中许多蛋白质较易结合阴离子，自然界中许多蛋白质较易结合阴离子，使等电点向使等电点向酸侧移动酸侧移动。(2)在使用等电点沉淀时还应考虑目的

41、物的稳定性。在使用等电点沉淀时还应考虑目的物的稳定性。 有些蛋白质或酶在等电点附近不稳定。如有些蛋白质或酶在等电点附近不稳定。如-糜蛋糜蛋白酶白酶(pI=8.18.6)，胰蛋白酶，胰蛋白酶(pI=10.1)，它们在，它们在中性或偏碱的环境中由于自身或其他蛋白水解酶中性或偏碱的环境中由于自身或其他蛋白水解酶的作用而部分降解失活。所以在实际操作中应避的作用而部分降解失活。所以在实际操作中应避免溶液免溶液pH上升至上升至5以上。以上。(3)生物大分子在等电点附近盐溶作用很明显。生物大分子在等电点附近盐溶作用很明显。 所以无论是单独使用或与溶剂沉淀法合用，都必所以无论是单独使用或与溶剂沉淀法合用，都必

42、须控制溶液的离子强度。须控制溶液的离子强度。4.4. 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法organic sovent organic sovent precipitationprecipitationl概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。l有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。l优点在于：优点在于：1 1）分辨

43、能力比盐析法高，即蛋白质等只在一）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2 2）沉淀不用脱盐，过）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；滤较为容易；l缺点是缺点是:1:1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2 2）操作要求在低温下进行。）操作要求在低温下进行。3 3）成本高）成本高l总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法机理有机溶剂沉淀法机理 *A 降低溶剂介电常数降低溶剂介电常数（介电常数（

44、介电常数D有机有机 D水）水） ，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。淀。*B 破坏水化膜：破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白子的溶剂化

45、能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。质沉淀。*C 相反力：相反力：疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层。合形成疏水层。有机溶剂沉淀法机理有机溶剂沉淀法机理降低介电常数破坏水化膜 后来又提出了另外一种说法，后来又提出了另外一种说法，认为有机溶剂沉淀认为有机溶剂沉淀法的机理是有机溶剂可能破坏蛋白质的某种键比法的机理是有机溶剂可能破坏蛋白质的某种键比如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面，并使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面，并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水作用，从而

46、与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水作用，从而使蛋白质沉淀。当蛋白质的空间结构发生变形超使蛋白质沉淀。当蛋白质的空间结构发生变形超过一定程度时，便会导致完全的变性。过一定程度时，便会导致完全的变性。常用的有机溶剂沉析剂常用的有机溶剂沉析剂选择依据：选择依据：(水溶性要好，沉淀用溶剂一般需能与水无限混溶，水溶性要好，沉淀用溶剂一般需能与水无限混溶，一些与水部分混溶或微溶的溶剂如氯仿、乙醚等一些与水部分混溶或微溶的溶剂如氯仿、乙醚等也有使用，但使用对象和方法不尽相同。也有使用，但使用对象和方法不尽相同。(沉淀作用要强，介电常数要小沉淀作用要强，介电常数要小(致变性作用要小致变性作用要小(毒性要小、挥发

47、性适中。沸点过低虽有利于除去毒性要小、挥发性适中。沸点过低虽有利于除去和回收，但挥发损失较大，且不安全。给劳动保和回收，但挥发损失较大，且不安全。给劳动保护及安全生产带来麻烦。护及安全生产带来麻烦。(容易获取容易获取 沉淀蛋白质和酶常用的是沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮乙醇、甲醇和丙酮。沉淀。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇乙醇是最常用的沉淀剂。是最常用的沉淀剂。(乙醇：乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；(丙酮丙

48、酮：沉析作用大于乙醇，用量小。如代替乙醇可：沉析作用大于乙醇，用量小。如代替乙醇可减少用量减少用量1/4-1/3，但沸点低、挥发大、着火点低、，但沸点低、挥发大、着火点低、对肝脏有一定毒性。应用范围不广；对肝脏有一定毒性。应用范围不广；(甲醇：甲醇：沉析作用与乙醇相当，对蛋白质的变性作用沉析作用与乙醇相当，对蛋白质的变性作用比乙醇和丙酮都小，但由于口服有强毒，限制了它比乙醇和丙酮都小，但由于口服有强毒，限制了它的使用。的使用。(其他溶剂：其他溶剂：如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、2-甲甲基基-2,4-戊二醇戊二醇(MPD)，乙腈，也可作沉淀剂用，乙腈，也可作沉淀剂用，但

49、远不如上述乙醇、丙酮、甲醇使用普遍。但远不如上述乙醇、丙酮、甲醇使用普遍。(60%乙醇的介电常数是乙醇的介电常数是48，丙酮的介电常数是，丙酮的介电常数是22，2.5mol/L甘氨酸的介电常数很大，可以用甘氨酸的介电常数很大，可以用作蛋白质等生物高分子溶液的稳定剂。作蛋白质等生物高分子溶液的稳定剂。溶剂浓度的计算溶剂浓度的计算 V=V0(S2-S1)/( 100-S2) V- V-需加入的有机溶剂的体积；需加入的有机溶剂的体积； V Vo o-原溶液体积；原溶液体积； S S1 1-原溶液中有机溶剂的浓度；原溶液中有机溶剂的浓度； S S2 2-需达到的有机溶剂的浓度；需达到的有机溶剂的浓度；

50、该公式与盐析公式一样该公式与盐析公式一样未考虑混合后体积的变化未考虑混合后体积的变化，实，实际上等体积的乙醇和水相混后体积会缩小际上等体积的乙醇和水相混后体积会缩小5，如此，如此的体积变化对大多数工作影响不大，在有精确要求的的体积变化对大多数工作影响不大，在有精确要求的场合可按摩尔比计算，这样可将体积变化因素抵消。场合可按摩尔比计算，这样可将体积变化因素抵消。（1）温度）温度n低温有利于防止溶质变性；低温有利于防止溶质变性；有机溶剂与水混合时要产生相有机溶剂与水混合时要产生相当数量的热量，从而使体系的温度升高，增加有机溶剂对当数量的热量，从而使体系的温度升高，增加有机溶剂对蛋白质的变性作用。因

51、此，在使用有机溶剂沉淀生物高分蛋白质的变性作用。因此，在使用有机溶剂沉淀生物高分子时子时务必要控制在低温下进行。务必要控制在低温下进行。n另外低温有利于提高收率（温度越低，溶解度越小）。另外低温有利于提高收率（温度越低，溶解度越小）。由由于大多数蛋白质在乙醇于大多数蛋白质在乙醇- -水混合溶液中的溶解度随温度下水混合溶液中的溶解度随温度下降而减少，低温对提高收率也是有利的。降而减少，低温对提高收率也是有利的。有机溶剂沉淀法的影响因素有机溶剂沉淀法的影响因素n用有机溶剂沉淀蛋白质时必须严格控制温度。用有机溶剂沉淀蛋白质时必须严格控制温度。n蛋白质在有机溶剂存在时，溶解度多随温度升高蛋白质在有机溶

52、剂存在时，溶解度多随温度升高而增加，如果形成沉淀后温度升高，沉淀可能重而增加，如果形成沉淀后温度升高，沉淀可能重新溶解，如果温度下降可能使沉淀增多新溶解，如果温度下降可能使沉淀增多( (杂蛋白杂蛋白) )。n一般都要低温操作。一般都要低温操作。n在有的情况下，把沉淀后清液的温度降低可沉淀在有的情况下，把沉淀后清液的温度降低可沉淀出另一种产品，这就是所谓出另一种产品，这就是所谓温差分级沉淀。温差分级沉淀。A A、预冷、预冷：为了达此目的，常将待分离的溶液和有机溶剂分别：为了达此目的，常将待分离的溶液和有机溶剂分别进行预冷。后者最好预冷至进行预冷。后者最好预冷至-10-10-20-20，在具体操作

53、时还应，在具体操作时还应不断搅拌。不断搅拌。 搅拌的作用一方面是为了散热，一方面为了防止溶剂局部过搅拌的作用一方面是为了散热，一方面为了防止溶剂局部过浓引起的变性作用和分辨率下降现象发生。为了以上目的，浓引起的变性作用和分辨率下降现象发生。为了以上目的，溶剂的加入速度也须控制，不宜太快。溶剂的加入速度也须控制，不宜太快。B B、短时间的老化处理：、短时间的老化处理：为减少溶剂对蛋白的变性作用，通常为减少溶剂对蛋白的变性作用，通常使沉淀在低温下作短时间的老化处理（使沉淀在低温下作短时间的老化处理（0.5-2h0.5-2h）后即进行离）后即进行离心分离，接着真空抽去剩余的溶剂，或将沉淀溶入大量的缓

54、心分离，接着真空抽去剩余的溶剂，或将沉淀溶入大量的缓冲液中以稀释溶剂，减少有机溶剂与目的产物的接触。冲液中以稀释溶剂，减少有机溶剂与目的产物的接触。 控制温度的具体做法：控制温度的具体做法：（2）pHnpH对溶剂的沉淀效果影响很大，适宜的对溶剂的沉淀效果影响很大，适宜的pH可使沉淀效果可使沉淀效果增强，提高产品的收率，同时还可提高分辨率。增强，提高产品的收率，同时还可提高分辨率。n许多蛋白质在等电点附近有较好的沉淀效果，但不是所有的蛋白质都是这样，甚至有少数蛋白质在等电点附近不太稳定。n在控制溶液pH时有一点要特别注意，即：务必使溶液中大务必使溶液中大多数蛋白质分子带有相同电荷，而不要让目的物

55、与主要杂多数蛋白质分子带有相同电荷，而不要让目的物与主要杂质分子带相反电荷，以致出现较严重的共沉作用。质分子带相反电荷，以致出现较严重的共沉作用。（3）离子强度）离子强度 n较低离子强度的存在往往有利于沉淀作用，甚至还有保护较低离子强度的存在往往有利于沉淀作用，甚至还有保护蛋白质，防止变性，减少水和溶剂相互溶解及稳定介质蛋白质，防止变性，减少水和溶剂相互溶解及稳定介质pH的作用。的作用。n用溶剂沉淀蛋白质时离子强度以用溶剂沉淀蛋白质时离子强度以0.01-0.05mol/L为好，通为好，通常不应超过常不应超过5%的含量。的含量。n如离子强度过高则溶剂用量大，沉淀物还会夹带许多的盐。如离子强度过高

56、则溶剂用量大，沉淀物还会夹带许多的盐。（4）样品浓度）样品浓度n与盐析相似，样品较稀时增加了溶剂投入量和损耗，降低与盐析相似，样品较稀时增加了溶剂投入量和损耗，降低了溶质收率，还易产生稀释变性，但共沉作用小，分离效了溶质收率，还易产生稀释变性，但共沉作用小，分离效果较好。果较好。n反之，浓的样品会增强共沉作用，降低分辨率，然而减少反之，浓的样品会增强共沉作用，降低分辨率，然而减少了溶剂用量，提高了回收率，变性的危险性也小于稀溶液。了溶剂用量，提高了回收率，变性的危险性也小于稀溶液。一般认为蛋白质的初浓度以一般认为蛋白质的初浓度以0.5%2%为好，粘多糖则以为好，粘多糖则以1%2%较合适。较合适

57、。 （5）金属离子助沉作用）金属离子助沉作用n在用溶剂沉淀生物高分子时还须注意到一些金属离在用溶剂沉淀生物高分子时还须注意到一些金属离子如子如ZnZn2+2+，CaCa2+2+等可与某些呈阴离子状态的蛋白质等可与某些呈阴离子状态的蛋白质形成复合物。形成复合物。n这种复合物的溶解度大大降低而不影响生物活性，这种复合物的溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂耗量，有利于沉淀形成，并降低溶剂耗量，0.005-0.005-0.02mol/L0.02mol/L的的ZnZn2+2+可使溶剂用量减少可使溶剂用量减少l/3l/3至至1/21/2，使，使用时要避免会与这些金属离子形成难溶盐的

58、阴离子用时要避免会与这些金属离子形成难溶盐的阴离子的存在的存在( (如磷酸根如磷酸根) )。实际操作时往往先加溶媒沉淀。实际操作时往往先加溶媒沉淀除去杂蛋白，再加除去杂蛋白，再加ZnZn2+2+沉淀目的物。沉淀目的物。n某些大分子聚合物，具有沉淀蛋白质的作用。某些大分子聚合物，具有沉淀蛋白质的作用。n非离子多聚物是非离子多聚物是20世纪世纪60年代发展起来的一类重年代发展起来的一类重要沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白要沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白(IgG)和沉和沉淀一些细菌与病毒，近年来逐渐广泛应用于核酸淀一些细菌与病毒，近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离纯化。和酶的分离纯化。n所用非离子

59、多聚物包括所用非离子多聚物包括各种不同分子量各种不同分子量的：的：聚乙聚乙二醇二醇(PEG)、壬苯乙烯化氧、壬苯乙烯化氧(NPEO)、葡聚糖、右、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯。旋糖苷硫酸酯。4.5 非离子型聚合物非离子型聚合物聚乙二醇聚乙二醇n结构式：结构式：HO-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OHnPEG相对分子质量从相对分子质量从200D到到20KDa的不同聚合程的不同聚合程度的产品都是有效的。度的产品都是有效的。n通常在蛋白质沉淀中使用通常在蛋白质沉淀中使用PEG-6000或或PEG-4000。使用使用PEG沉淀分离蛋白质方法的优点沉淀分离蛋白质方法的优点 沉淀温度只需控制在室温条

60、件下；沉淀温度只需控制在室温条件下； 沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集；沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集； PEG非但不会使蛋白质变性，而且可以提高它的非但不会使蛋白质变性，而且可以提高它的稳定性。稳定性。使用使用PEG沉淀分离蛋白质方法的缺点沉淀分离蛋白质方法的缺点1、PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去，为比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去，为此需用超滤和液液萃取来解决。此需用超滤和液液萃取来解决。2、价格较昂贵。、价格较昂贵。n一是一是选用两种水溶性非离子多聚物组成液选用两种水溶性非离子多聚物组成液- -液两相系统。液两相系统。使使生物大分子或微粒在两相系统中不等量分配，