黄酮标准曲线绘制的实验报告

1、黄酮标准曲线绘制的实验报告1.1 实验仪器电子天平AR2140;紫外可见分光光度计UV2754;型数控超声波清洗器KQ3200DB;超级恒温槽;RotavaporR200旋转蒸发仪;FD21C250冷冻干燥机21.2 试剂及药品芦丁标准品硝酸铝国产分析纯配成5%亚硝酸钠国产分析纯配成10%氢氧化钠国产分析纯配成配成1mol/L95%乙醇，无水乙醇国产分析纯配成60%乙醇50%乙醇DPPH2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,二苯代苦味肌基自由基VcAscrobicacid，维生素C，抗坏血酸没食子酸对照品：基准纯。大青叶子采摘于海南大学东坡湖畔1.3 实验步骤：及波长确实

2、定样品60烘干粉碎机粉碎，过20目筛，装入试剂瓶中备用。根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。精密称取120C,用60猿醇溶解后定容至25mL容量瓶中，摇匀，即可得1.5mg/mL的芦丁标准溶液。及绘制标准曲线精密吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,分别置于10mL容量瓶中，并定容至刻度线。得到0.0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml的标准品溶液，分别取1ml到试管中各力口5%mL摇匀，放置6min,加10%mLffi匀，放置6min，加1mol/L氢氧化钠溶液

3、4mL,再用60叱醇溶液稀释至刻度，放置15min后，分别在510nm处测定其吸光度Tai,Cai&Dai,2011。以试剂空白做参比以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合，得c与A的线性回归方程以及相关系数R2o在舁厅Pug/ml1002150.1803300.3494450.5465600.7276750.8847901.063表1-1:产丁标准曲线测定数据y-ClOllSx-l-U.0023R"2=Q.皴如一IOC204060SORutinconcentralion(ufi/ml)图1-2:芦丁标准曲线根据查阅文献总黄酮在波长为510

4、nm处吸收值最大。取黄酮提取液，取提液2ml至10ml的比色管中用60%勺乙醇定容至亥U度线则稀释5倍。取稀释好的溶液4份1ml置入10ml的比色管中，其中一份用60%勺乙醇定容，作为参比溶液。其余各份各加5%mLM匀，放置6min，加10%mL|i匀，放置6min,加1mol氢氧化钠溶液4mL,再用60%L醇溶液稀释至刻度，放置15min后，分别在510nm处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓度数据以产丁为参比，三次结果取平均值。经换算后得样品中总黄酮含量。样品总黄酮含量(mg/g)=X*n*V1/(V*W)式中：X测出的浓度，mg/mL;直接代入，不用换算。n一稀释倍数，量纲为1;V

5、一样液总体积，mL;Vi测定时取样体积，mL;VW-样品质量，go2.1实验仪器ALZO例电子分析天平：上海梅特勒一托利多仪器；DELAJE。型pH计：上海梅特勒一托利多仪器；723可见分光光度计:上海菩华科技仪器;DK512型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器；容量瓶(250mL,100mL25mL)、比色管管(10mL);烧杯、移液管、吸耳球。没食子酸对照品：基准纯，购于上海分析试剂厂，置50真空干燥箱真空中干燥4h。乙醇为工业级，蒸馏水，其他试剂均为分析纯。2.3FolinCiocalteu比色法测定总酚酸含量3.3.1FolinCiocalteu试剂的配制称取20g鸨酸钠和5g铝酸钠于圆

6、底烧瓶中，用140ml蒸储水溶解，加入10ml85%的磷酸溶液和20ml浓盐酸，文火回流10h,然后加入3g硫酸锂及15ml双氧水，加热沸腾15min至亮黄色，不得带微蓝和绿色。冷却，移入250ml容量瓶中，定容，贮于棕色瓶中，4冰箱保存。准确称取15.00m时燥的没食子酸，加蒸储水适量，超声溶解，放冷，以蒸储水定容至50mlmg/mLS食子酸的溶液，作为对照品溶液。将0.3mg/mL的没食子酸标准?§液分别配制成0.0mg/mL,0.03mg/mL,0.06mg/mL,0.09mg/mL,0.12mg/mL,0.15mg/mL、0.18mg/mL、0.21mg/mLfl勺溶液，分别

7、取1mLS于10mLi勺容量瓶中，加入2ml福林试剂，充分摇匀，加入0.75ml7.5%碳酸钠溶液混匀，以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下，静置2h(Guo&Wei,2011)。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。于765nm波长处测定吸光度值。2以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合，得c与A的线性回归方程以及相关系数R2o序号浓度一吸光度WL765Oug/mlJ0001 32 63 94 125 156 187 21表3-1:没食子酸标准曲线测定数据图3-1:没食子酸标准曲线取提液2ml至10ml的比色管中用60

8、%勺乙醇定容至亥U度线则稀释5倍。取稀释后溶液1ml四份，分别置于10mL比色管中,加入2ml福林试剂，充分摇匀，加入0.75ml7.5%碳酸钠溶液.混匀，以蒸储水稀释至刻度。振荡一下，静置2h0同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。于765nm波长处测定吸光度值。总酚酸含量计算：多酚含量mg/100gX(mg)稀释倍数0.5总酚酸称样量(g)1003.清除DPPH-的能力的测定3.1. 实验仪器、药品及试剂3.1.1 实验仪器ALZO例电子分析天平：上海梅特勒一托利多仪器DELAJE。型pH计：上海梅特勒一托利多仪器；723可见分光光度计：上海菩华科技仪

9、器；DK512型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器；容量瓶(250mL,100mL25mL)、比色管(10mL);烧杯、移液管、吸耳球。DPPH2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,二苯代苦味肌基自由基；VcAscrobicacid,维生素C,抗坏血酸为分析纯；无水乙醇，蒸储水配制0.06mMDPPH剂J,放入冰箱4c进行冷藏，以备用。准确称取17.6mgVc至I100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50mL的容量瓶中定容至刻度线及可以得到2mmol/L的母液，分别量1、2、3、4、5、6ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到0.2mmol/L、0.4

10、mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L的溶液。从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再加入3.9ml的DPPH反应30min,在517nm测出吸光值(Thoo&Ho,2010),用无水乙醇代替待测液作为对照，用无水乙醇作空白，重复三组。消除率=(Ac-Ai)/AcX100%式中，Ac：0.1mL无水乙醇加3.9mLDPPH溶液的吸光度；Ai:0.1mL待测液加3.9mLDPPH溶液的吸光度。Cmmol/L吸光度消除率/%0123456014.92046.7363.6278.6992.39用最小二乘法进行0.1WT Concent

11、r at icmmol/Ly=-0.G140rH).e286F 2 - 口，999】表3-1:VC标准曲线测定数据以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制标准曲线。线性拟合，得c与A的线性回归方程以及相关系数R。0.fi图3-1:VC含量与吸光度的关系vaoaAIEuMTECTPEM图3-1:VC含量与清除率的关系取提液mL三份，分别置于10mL试管中，再分别加入配置好的DPPH溶液3.9mL,摇匀，反应30min后，分别在517nm处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓度数据以Vc为参比,三次结果取平均值。经换算后得样品自由基清除率。4.清除ABTS自由基能力的测定+自由基的配制准确称取

12、0.19215gABTS于50mL的容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，浓度7mmol/L；7mmol/LABTS+.与2.45mmol/L的高硫酸钾等体积混合，在室温、避光黑暗的条件下静置过夜反应1216h,形成ABTS+自由基储备液。该储备液在室温，避光的条件下稳定。用前用无水乙醇稀释成工作液，于波长734nm处测得其吸光度为0.7000±0.02，再装入棕色试剂瓶中，放入冰箱4进行冷藏，以备用。准确称取8.8.mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线及可以得到1mmol/L的母液，分别量1、2、3、4、5、6、7、8ml至10ml的

13、比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L的溶液。从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再加入3.9ml的DPPH，反应30min,在517nm测出吸光值，用无水乙醇代替待测液作为对照(Zhu&Lian,2011)，用无水乙醇作空白，重复三组。消除率=(Ac-Ai)/AcX100%式中，Ac：0.1mL无水乙醇加3.9mLABTS+自由基溶液的吸光度；ABTS+自由基溶液的吸光度。076543210o.0,0.o.o.o.s

14、&xoqgsqv雷出MUTafluAgQs在耳）了节123456789Cmmol/l0吸光度消除率/%0.0012.0423.9234.8845.8357.4169.1481.7994.60表4-1:Vc浓度与吸光值和清除率的数据y=-0.7573X+0.6489R*2=0,99920.20.40.60.SVCConcentrationibo1/1图4-1Vc浓度与其吸光值的关系y=116.T7k-0.00570.20.40.6VCConcentTationuol/10.S图4-2:Vc浓度与其清除ABT碓力的关系5.复原能力的测定磷酸盐缓冲溶液配成PH6.

15、60.2mol/l;K3Fe(CN)6溶液配成1%;三氯乙酸配成10%；FeCl3配成0.1%；没食子酸无水乙醇磷酸盐缓冲溶液(pH6.60.2mol/L)：准确称取7.16g的磷酸氢二钠至100mL的烧杯中用蒸馏水溶解后，置于100mL的容量瓶中用蒸馏水定容，即可得到0.2mol/L的磷酸氢二钠，同样的方法配制0.2mol/L的磷酸二氢钠。准确量取37.5mL的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和62.5mL的0.2mol/L磷酸二氢钠溶液至烧杯中，用pH校正既可以得到磷酸盐缓冲溶液(pH6.60.2mol/L)。用没食子酸做标准曲线其浓度范围在50300ug/ml,准确称取50mg没食子酸到1

16、00mL烧杯中用无水乙醇溶解后，置于容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线，得到0.5mg/ml的母液，在分别取1mL2mL3mL4mL5mL6mL至10mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度先，得到50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml的溶液，取不同浓度的待测液或样品1ml于试管中，依次加入PH6.6磷酸盐缓冲溶液0.2mol/l2.5ml和1%K3Fe(CN)6溶液2.5ml后混合均匀，混合液于50水浴20min,再加入10%的三氯乙酸2.5ml。于3000r/min离心10min,取2.5ml的上清液再依次加2.5ml蒸储水和0.1%

17、的FeCl30.5ml混合均匀，静置10min在700nm处测定吸光值，通过在700nm下的吸收值来测量提取物的复原能力，吸光值越高说明复原力越强，EC50Roy&Laskar,2011。gallicacidTestsetconcentrationAbsorbencyug/ml12345670050100150200250300表5-1:没食子酸的质量浓度和吸光值的数据Gallicacidconcentrationug/nl图5-1:没食子酸的质量浓度与其吸光值的关系6.超氧自由自测定1实验试剂Tris-Hcl缓冲液配制PH8.2050mmol/L邻苯三酚(配制3mmol/L)VC无水

18、乙醇6.2.1试剂的配制Tris-HClpH8.250mmol/L缓冲溶液：取0.6057g三羟甲基氨基甲烷Tris，蒸储水溶解定容至50mL容量瓶；取0.309mL分析纯盐酸溶液至100mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，即得0.1mol/L盐酸溶液；分别取配置好的Tris50mL和0.1mol/L盐酸溶液22.9mL于100mL量瓶中，蒸储水定容至刻度，用pH计进行校正即可以得到Tris-HClpH8.250mmol/L缓冲溶液。邻苯三酚：配制10mmol/L的稀盐酸，取0.310mL分析纯盐酸溶液至1000mL的容量瓶中用蒸储水定容至刻度线；取焦性没食子酸0.0095g,至25mL的容量并中用10mmol/L的稀盐酸溶液定容至刻度线。g置于100mL烧杯中，用纯洁水溶解后定容至