分析仪器基本知识

1、液相色谱基本常识.色谱法的原理利用混合物中各组份在不同的两相中溶解，分配，吸附等化学作用性能的差异，当两相作相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。两相中有一相是固定的，叫作固定相，也就是咱们的色谱材料；有一相是流动的，称为流动相，流动相又叫洗脱剂。二.色谱类型1 .按流动相的物态分气相色谱(GasChromatography,GC)-用气体作为流动相(又叫载气)。液相色谱(LiquidChromatography,LC)-用液体作为流动相(又叫洗脱剂)。2 .按固定相的形态分：(1)平面色谱：纸色谱、薄层色谱。(2)柱色谱三.定义高效液相色谱法：是一种区别于经典液

2、相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段。组成：高性能色谱柱，高精度输液泵，高灵敏度检测器3 .特点优点：高效(60000理论塔板/米)、高速(110mL/min)、高灵敏度(微升数量级)，高压(150300kg/cm2)、高精度、高自动化高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。缺点：仪器设备价格昂贵4 .高效液相色谱柱发展史19世纪70年代中期，HPL或开始出现，主要填料：10师的无定型硅胶颗粒。70年代后期，发展了反相液相色谱。80年代，HPLC被广泛应用于化合物的分离，主要填料：粒径为510师球形硅胶。90年代早期，粒径为5叩的高纯硅胶，即所谓的B型硅胶被发展，并成为这个行业填料的

3、标准，这种B型硅胶含有微量的金属。90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了3m或3.5即的球形硅胶，其作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。21世纪早期，为适应超快速的分离要求，粒径小于2叩的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。目前，市场上流行的分析用的HPLC硅胶基质填料主要为B型硅胶。5 .高效液相色谱柱的基质材料(1)硅胶优点：目前应用最为广泛的基质材料。高机械强度和高的比表面积。可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求。重现性好。pH适用范围为pH28。缺点：具有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基。

4、(2)聚合物：交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯优点：pH稳定性好：pH113。可以在很宽的范围内进行表面化学处理以满足反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求。在中等pH条件下对强碱性物质具有更好的峰形。缺点：填料的体积随着流动相的不同而改变，如膨胀或收缩。分离效率相对硅胶而言比较低。重现性不好。6 .色谱柱的分类常见的分配柱填料：碳十八柱(ODS/C18)碳八柱(MOS/C8、碳六柱(Hexyl/C6)、碳四柱(Butyl/C4)、碳一柱(Methyl/C1)、阴离子交换柱（SAX卜阳离子交换柱（SCX、苯基柱（Phenyl）、氨基柱（Amino/NH2、富基柱（Cyan

5、o/CN/Nitrile）常见的吸附柱填料：硅胶柱、富基柱、氨基柱HPLC色谱操作注意事项1.流动相(1)流动相应选用HPLCt剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；(2)流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。(3)水相流动相需经常更换(一般不超过2天)，防止长菌变质；(4)使用双泵时，A、RC、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D(进液口位于混合器下方)放置含盐流动相，RC(进液口位于混合器上方)放置不含盐流动相；2.样品(1)样品必须经过0.45区滋0.22区的勺滤膜过滤，确保样品中不含固体颗粒；(2)用流动相

6、或比流动相弱(若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小)的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；(3)手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的35倍；(4)每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂(如甲醇)等清洗进样器3.色谱柱(1)使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH范围、不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品；(2)连接色谱柱时，应注意连接方向，防止反接、反冲色谱柱；(3)使用保护柱；(4)长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)。(5)常规C18ft绝对不能进蛋白样品，血样、

7、生物样品。(6)不要高压冲洗柱子；(7)不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；使用过程中注意轻拿轻放。4.操作过程1 .注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液；2 .使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。3 .堵塞导致压力太大，按预柱-混合器中的过滤器-管路过滤器-单向阀检查并清洗。清洗方法：以异丙醇作溶剂冲洗；用10%稀硝酸清洗。4 .检测器进气泡，用高有机溶剂冲洗5 .先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相），正式进样分析前30min左右开启D丁或V

8、灯，以延长灯的使用寿命；6 .建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Method,勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；5 .使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；6 .溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5嘛硝酸溶液浸泡后再洗涤；7 .实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。冲洗过程中关闭DT、V灯；8 .关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色

9、谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关；9 .使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时向老师报告，不要擅自拆卸仪器。未经操作培训，不得擅自使用仪器。气相色谱1 .色谱法的基本原理溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。2 .按流动相形态分为：气相色谱：气固色谱、气液色谱液相色谱超临界流体色谱三、化学分析的目的：1 .要确定被分析物是什么性质，即给物质定性。1)已知对照物定性2)相对保留值定性2 .要确定被分析物中每个组份的含量的大小，即给物质定量。以峰高或峰面积定量1).归一化法2

10、).外标法3).内标法4).内标对比法气源一色谱柱一检测器一晨需紫外可见吸收光谱统称为电子光谱。紫外-可见吸收光谱法是利用某些物质的分子吸收200800nn谱区的辐射来进行分析测定的方法。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于有机和无机物质的定性和定量测定。紫外可见吸收光谱的特点(1)紫外可见吸收光谱所对应的电磁波长较短，能量大，它反映了分子中价电子能级跃迁情况。主要应用于共钝体系(共钝烯炫和不饱和玻基化合物)及芳香族化合物的分析。(2)由于电子能级改变的同时，往往伴随有振动能级的跃迁，所以电子光谱图比较简单，但峰形较宽。一般来说，利用紫外可见吸收光谱进行定性分析信号较少。(3)紫外可见吸收光谱常用于共钝体系的定量分析，灵敏度高，检出限低。1、紫外-可见分光光度计的基本结构：紫外-可见分光光度计由光源、单色器、吸收池、检测器以及数据处理及记录(计算机)等部分组成。1、基本原理：不同的有机化合物具有不同的紫外可见吸收光谱，可进行简单的定性分析；同一化合物在不同浓度下的吸光度在一定条件下符合朗伯-比尔定律：所以我们可以利用有机物的紫外可见光谱进行定性分析和定量分析利用傅立叶红外技术检测的工作原理光源发出的红外光经干涉仪转变成干涉光，通