胚胎发育的核小体重排和染色质重塑

1、项目名称：胚胎发育的核小体重排和染色质重塑首席科学家：江赐忠 同济大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部 上海市科委一、研究内容从受精卵到胚胎的发育过程是一个非常复杂的生理过程，要求基因在时空上的精确转录表达。而核小体作为染色质的最基本结构，通过屏蔽和开放DNA来调控基因的转录。前人研究已经表明在胚胎发育过程中，染色质结构发生了巨大的变化。但是，还不清楚胚胎发育、胚胎干细胞分化、以及成熟体细胞逆分化为多能干细胞（iPS细胞）的过程中核小体定位、染色质结构发生了什么样的变化？以及这些变化对胚胎发育、干细胞分化、iPS细胞多能性获得等具有怎样的决定作用？这些变化的分子机制是什

2、么？（构成核小体的）组蛋白修饰和DNA甲基化在核小体重排和染色质重塑中的作用及机制如何？以上这些都是本项目的关键科学问题。针对上述科学问题，本项目包括以下主要研究内容:1. 从胚胎发育、体细胞重编程、干细胞分化三个方向研究核小体重排和染色质重塑。具体来说:1) 在胚胎水平上, 以果蝇为模式生物, 在典型的两个发育时间点, 分别绘制果蝇胚胎高分辨率全基因组核小体图谱，再比较核小体定位和染色质结构的变化; 类似地，分析比较野生型和突变体中核小体定位和染色质结构的变化;揭示核小体定位和染色质结构变化的本质规律。以期阐明核小体定位和染色质结构在维护胚胎正常发育中的作用和分子机制。并建立一套稳定适用于多

3、物种的高分辨率全基因组核小体图谱的高效绘制方法。2) 分别绘制胚胎干细胞和iPS细胞多能性诱导后的高分辨率全基因组核小体图谱，通过比较核小体定位和染色质结构的异同, 可以揭示核小体定位和染色质重塑对这两种不同细胞维持多能性中的作用机制，这为理解干细胞分化、iPS细胞多能性获得具有重要意义。同时分析特定组蛋白修饰对核小体定位的影响，鉴定发现与体细胞重编程有关的因子，研究该因子对组蛋白特异性修饰与核小体定位的影响。2. 影响核小体重排和染色质重塑的因素很多, 其中DNA甲基化和组蛋白修饰是重要的两个。利用模式蛋白UHRF1研究DNA甲基化和组蛋白甲基化之间的互动关系, 以及二者对核小体定位和染色质

4、重塑的调控机制。再以经基因剔除处理过的小鼠胚胎干细胞为材料, 进一步研究DNA甲基化、组蛋白甲基化和核小体重排对干细胞分化的作用。3. DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑因子的作用、核小体重排和染色质重塑是个复杂的调控网络。因此，本项目还将从表观遗传组学的角度上宏观分析这一调控网络: 整合基因组学、比较基因组学和细胞信号转导通路数据，构建表观遗传组学数据中心；建立表观遗传组学分析平台；系统研究核小体重排、组蛋白修饰与转录因子之间的相互作用。另外, 本项目涉及高通量数据的处理, 我们将开发相应高通量鉴定组蛋白修饰差异和核小体定位变化的分析工具。二、预期目标总体目标：本项目以模式动物胚胎发育和细

5、胞分化过程中核小体重排和染色质重塑为基本问题，整合国内优秀团队，利用当前最先进的研究手段和技术，从分子生物学、发育学和基因组学等方向上进行研究。具体来说是，阐明果蝇胚胎发育、体细胞重编程和干细胞分化中核小体分布和染色质结构的变化规律，组蛋白修饰和染色质重塑因子对核小体重排和染色质重塑的作用机制。以期揭示核小体重排和染色质重塑在维护胚胎正常发育中的作用和分子机理，以及在体细胞重编程中的作用；同时开发高通量分析方法，建立表观遗传组学数据中心和分析平台，进一步阐明核小体重排和组蛋白修饰在基因转录调控网络中的重要作用。通过本项目的结题，将获得一批有自主知识产权的重要成果，提高国家科研实力，为解决不断上

6、升的由发育异常导致的缺陷新生儿以及预防、诊断和治疗其它与表观调控异常关联的疾病提供理论依据，并提高iPS细胞诱导效率，为加快iPS细胞在组织移植和器官移植中的临床应用打下技术基础。五年预期目标：1. 绘制果蝇胚胎发育关键时期和特定基因突变体的高分辨率全基因组核小体图谱，阐明核小体重排和染色质结构在发育过程中的变化和功能，建立一套稳定的可应用于不同物种的绘制高分辨率核小体图谱的方法。2. 绘制胚胎干细胞和iPS 细胞的高分辨率全基因组核小体图谱，分析比较二者的核小体重排和染色质重塑的异同。揭示核小体重排和染色质重塑在维持胚胎干细胞和iPS 细胞全/多能性中的作用。3. 以UHRF1为模式蛋白，研

7、究组蛋白修饰和DNA甲基化之间的互动关系，并对核小体重排的作用。利用UHRF1敲除小鼠胚胎干细胞为材料，阐明组蛋白修饰、DNA甲基化和核小体重排在胚胎干细胞分化中的作用机制。4. 开发一套高效分析鉴定核小体定位变化和组蛋白修饰差异的计算生物学方法，建立国内首个专门针对核小体定位、组蛋白修饰、顺式调控元件、及它们相互作用的表观遗传组学数据中心和分析平台。5. 预期本课题结题时，在国际一流学术刊物（IF>10）上发表论文8-15篇，在有影响力的杂志（IF>5）上发表论文23-38篇以上。申请专利4项以上。6. 培养博士后12-15人，博士研究生25-40人，继续培养和壮大国内核小体重排

8、与染色质重塑在胚胎发育和细胞分化中的作用这一表观遗传调控领域的专业研究队伍。三、研究方案本项目的研究设置分为四部分，力图阐明胚胎发育、干细胞分化、iPS细胞重编程过程中核小体重排和染色质重塑的机制和功能；把核小体重排和染色质重塑等表观遗传机制与发育异常相关的疾病等有机结合起来。第一、二部分分别从果蝇胚胎不同发育时期、不同突变体，及成熟体细胞向多能干细胞重编程的角度，研究组蛋白修饰、核小体定位和染色质结构的变化规律和作用机制；鉴定在成熟体细胞重编程过程中起关键作用的调控因子和信号分子，及其在核小体重排和染色质重塑中的作用机制；第三部分从关键组蛋白修饰识别蛋白出发，分析其调控组蛋白修饰、核小体定位

9、和染色质重塑的分子机制，及这些表观遗传机制在干细胞全能性维持和分化中的功能；第四部分从表观组学角度，收集和整合本项目数据与公共数据，开发集数据中心和分析平台于一体的表观组学数据综合分析系统，系统研究组蛋白修饰、核小体重排与转录因子之间的相互作用，及三者在基因转录调控网络中的协同功能。四个部分分别侧重于胚胎、细胞、基因组和高通量分析方面，进行较系统的表观遗传学研究，既突出重点，又相互促进。高分辨率全基因组核小体图谱的绘制在国际上才刚刚起步，在我国还是空白；组蛋白修饰、核小体重排和染色质重塑在iPS细胞形成中的功能和机制尚不清楚；组蛋白修饰识别蛋白UHRF2调控组蛋白修饰、核小体定位和染色质结构的

10、分子机制还未见报道。这些研究都具有很强的创新性和前沿性。本项目紧密围绕这些问题，组建国内优秀团队，以期在这些问题上获得突破。本团队成员绘制了果蝇的第一张核小体图谱，建立了稳定的iPS诱导体系，鉴定分离到UHRF2，开发了优秀的生物信息学工具，在相关领域有雄厚的基础，掌握相关的技术。因此，本团队完全能够实施本项目研究方案和取得预期目标与重大突破。下面分别详细介绍各个部分的学术思路、研究方案，以及创新性和可行性。课题一 果蝇胚胎发育过程中的核小体重排和染色质高级结构的变化果蝇从受精卵发育到成虫的过程中，DNA要进行快速的复制，基因要进行大量而精确的转录表达以供细胞分裂分化和生长发育所需。在这个生理

11、过程中的不同阶段，染色质结构相应地发生了巨大的变化。本课题以核小体为基本研究对象，探索在果蝇不同发育阶段，全基因组核小体排列分布的变化和染色质高级结构的变化，阐明它们在果蝇发育过程中影响基因转录的分子机制。具体而言，拟在果蝇发育过程中选取两个具有代表性的时间点：1）原肠形成期（Gastrulation），外胚层开始内陷形成中胚层和内胚层。2）神经分化形成期，中央神经系统（CNS）和外周神经系统（PNS）开始分化发育。收集这两个时期的果蝇胚胎，提取出单核小体。再用高通量测序技术测出核小体DNA序列，把其比对定位到果蝇基因组上。这样可以获得这些序列在每条染色体上的位置。在此基础上，利用生物信息学的

12、方法，进一步预测出核小体，并得到高分辨率全基因组核小体图谱。果蝇的基因、各种顺式调控元件、转座子等在基因组上都有很清楚的标注。通过比较研究核小体和这些元素之间的位置关系，可以得到核小体的排列分布模式。例如，核小体是富集在基因编码区还是非编码区？核小体空白区又主要分布在何处？核小体的排列分布可以揭示在果蝇发育的特定阶段，染色质开放和关闭区域的分布情况，哪些基因被激活，哪些基因处在休眠。再通过比较研究染色质开放和关闭区域的分布、激活的基因、休眠的基因在不同发育阶段的变化，可以比较清楚地阐述核小体重排和染色质结构的变化在胚胎发育中的作用机理。另外，选择果蝇 brm突变体，研究它的核小体重排和染色质重

13、塑。brm突变导致果蝇神经发育异常。（brm突变在人类则导致Williams综合症，性状包括发育迟缓， 智力发展迟缓 ，早衰，走路笨拙等。）Edward Lewis对果蝇突变体进行研究，发现果蝇不同体节有不同的发育途径，由不同基因控制，并分享了1995的诺贝尔生理学或医学奖。针对这一典型突变体，应用上述技术，分别测定 brm突变体的高分辨率全基因组核小体图谱，再和野生型的核小体图谱进行基因组学上的比较，探索二者之间的核小体重排和染色质结构变化，进一步揭示这些基因的突变如何通过影响核小体重排来调控其靶基因的转录表达，从而造成发育异常。此项研究在探索核小体重排和染色质结构变化在胚胎正常和缺陷发育中

14、的作用机制具有重大意义。总体研究方案图示如下：发育时间点2野生型果蝇胚胎果蝇 brm突变体发育时间点1野生型果蝇胚胎预测核小体构建核小体图谱比较基因组学鉴定核小体重排阐述影响胚胎发育的机理预测核小体构建核小体图谱预测核小体构建核小体图谱比较基因组学鉴定核小体重排阐述造成胚胎发育异常的机理甲醛固定裂解细胞分离染色质核酶消化得到单核小体染色质免疫沉淀收集核小体胶纯化PCR扩增测序甲醛固定裂解细胞分离染色质核酶消化得到单核小体染色质免疫沉淀收集核小体胶纯化PCR扩增测序甲醛固定裂解细胞分离染色质核酶消化得到单核小体染色质免疫沉淀收集核小体胶纯化PCR扩增测序本部分工作采用高通量测序技术研究单核小体动

15、态分布对果蝇发育过程的影响和作用机制，具有很高的创新性和可行性。在此部分研究中，我们首次在果蝇的不同发育阶段探索核小体重排和染色质高级结构对发育的影响。这是一个全新的研究思路。此外，关于果蝇高分辨率全基因组核小体图谱，目前国际上只有一篇报道，是由课题负责人于2008年发表在Nature杂志上，用的是H2A.Z核小体变体。在此基础上，本课题用野生型核小体为研究对象，因此可行性很强，在国际上也有很大的优势。这一部分课题的研究组成员，在果蝇发育、突变体培养、高通量测序技术应用和数据分析上都分别有多年的工作经验、扎实的知识与技术积累，并取得很大的学术成果，在高影响因子的杂志上发表文章。因此，本课题组的

16、研究成员完全能够实施课题研究方案和实现预期目标。课题二体细胞重编程过程中核小体重排和染色质重塑本课题的关键科学问题包括：核移植和iPS细胞形成等体细胞重编程过程中，核小体的分布和染色质结构发生了怎样的变化？组蛋白修饰和信号转导是如何影响体细胞重编程中的核小体重排和染色质重塑的？最终组蛋白修饰、核小体重排和染色质重塑在体细胞重编程中有什么作用，作用机制是什么？针对这些问题，我们设计了如下研究方案：1 iPS细胞诱导技术的建立。在已有基础上，集中力量优化3T3细胞系iPS细胞诱导技术。2 建立和完善可诱导iPS细胞体系，得到完全由可诱导iPS细胞来源的小鼠，从而分离到均一的含可诱导病毒载体的体细胞

17、。3 利用ChIP-Seq技术，全基因组范围内研究iPS细胞形成中特异性修饰的组蛋白定位、核小体定位和染色质结构的变化。4 利用生物信息学手段，分析这些高通量数据，预测在iPS细胞形成中调节基因转录、组蛋白修饰变化、核小体定位和染色质重塑等可能的关键分子（组蛋白修饰酶、染色质重塑酶等）。5 利用基因操作干预这些关键分子，研究它们在iPS细胞形成中是否起作用。选择显著影响iPS细胞形成的分子进行后续研究。6 利用siRNA技术，逐个knock down影响iPS细胞形成的关键分子，用ChIP- chip技术和cDNA芯片分别研究这些酶表达的降低对基因转录、组蛋白修饰、核小体定位和染色质重塑的调节

18、作用。7 利用已经报道可以调节这些关键分子活性的小分子化合物，进一步确证基因操作的结果。8 利用生物信息学分析研究在iPS细胞形成中这些关键分子可能形成的信号转导通路。9 利用基因操作干预这些可能信号通路中的关键分子，研究这些分子对组蛋白修饰酶特异性、核小体定位、染色质重塑等的作用。10 利用基因操作和小分子化合物验证这些关键分子和网络在iPS细胞形成中的作用。最终全面阐述组蛋白修饰、核小体定位和染色质重塑在iPS细胞形成中的作用和机制。本研究的技术路线可以概括为如下图所示：体细胞重编程中基因转录、组蛋白特异修饰、核小体定位和染色质结构变化的高通量数据获取生物信息学分析数据，预测在这些修饰变化

19、中起关键作用的因子、特定组蛋白修饰酶、染色质重塑酶及信号分子用基因敲除技术研究特定组蛋白修饰酶、染色质重塑酶及信号分子等在这些修饰变化中的作用及机制鉴定信号通路调节剂、组蛋白修饰酶抑制剂等小分子化合物，进一步确定上述作用和分子机制分析信号通路调节剂、组蛋白修饰酶抑制剂等小分子化合物对核小体重排和染色质重塑的影响，研究核小体重排和染色质重塑等在体细胞重编程中的作用及机制近期的研究显示，组蛋白甲基化酶的抑制剂和去乙酰化酶的抑制剂都能大幅提高iPS细胞的形成效率。这显示组蛋白修饰在细胞重编程中具有极其重要的作用。但组蛋白修饰在iPS细胞形成中的功能和机制尚不清楚。我们认为，组蛋白修饰的一个重要作用就

20、是改变基因组范围内核小体的定位和染色质结构，从而特异性调节基因转录和表达，因此本研究紧紧围绕组蛋白修饰、核小体定位和染色质重塑展开，这样的研究具有创新性。同时，我们对组蛋白修饰、核小体定位和染色质重塑的研究还关注到调节这些过程的信号分子、相关酶起作用的靶分子和这些酶间的相互作用，相信这样的研究可以较为全面地揭示组蛋白修饰等在iPS细胞诱导中的作用网络和关键分子，一定能够得到原创性的成绩。此外，充分利用信号转导通路研究较为清楚的特点，利用信号通路的激动剂和抑制剂研究组蛋白修饰、染色质重塑特异性的机制及其对iPS细胞形成的作用，也很有创新，相信不仅有助于iPS细胞形成机制的阐明，而且有助于iPS细

21、胞诱导技术的进一步发展和完善。iPS细胞的成功正是基于科学家们对研究胚胎干细胞和体细胞核移植研究的基础上产生的。而体细胞核移植可以将分化的体细胞恢复到最原始的全能性状态，但是其间发生的机制却至今不清楚，从而造成克隆胚胎发育低下的状态迟迟没有改善。我们的研究已经证明体细胞克隆胚胎发育过程中组蛋白修饰与正常胚胎存在显著的差异，而这些差异可能造成染色质重组，核小体组装的缺陷，从而造成克隆胚胎的发育异常，我们的研究将有助于我们进一步通过改变相应基因的表达来提高克隆胚胎的发育。本研究涉及的主要技术有体细胞核移植技术，胚胎干细胞培养技术、iPS细胞诱导技术、iPS细胞鉴定技术、信号转导、基因干预技术、蛋白

22、组学、ChIP-PCR、ChIP-Seq、基因转录分析和生物信息学分析等技术。关键技术为新兴的iPS细胞诱导和鉴定技术，以及表观遗传组学分析技术等，经过一年多的摸索，目前我们已经较好地掌握了这些系列技术。项目中涉及的其它方法和技术也都是我们研究团队的特长和优势技术，在以往的研究中也都已经应用过。因此，我们的研究不存在技术上的障碍，研究方案是可行的。同时，本课题的承担单位具有高效的管理系统、专业的技术支持系统、优秀的研究生生源等，足以保证我们项目的顺利进行。课题三 胚胎干细胞中组蛋白修饰、DNA甲基化和核小体定位的互动机制以ICBP90家族成员UHRF1和UHRF2为模型，阐明组蛋白修饰识别蛋白

23、在对胚胎干细胞的DNA甲基化、组蛋白修饰、核小体重排和染色质重塑的调控作用和机制，以及研究组蛋白修饰和DNA甲基化之间的互动及其在基因组水平上对核小体定位和染色质重塑的影响。围绕这一总体目标，我们的总体研究方案可分为三个部分：1）利用生化、分子与结构生物学方法 （pulldown, deletion and point mutations,crystal structural analysis），比较分析UHRF1和UHRF2识别H3K9甲基化和DNA甲基化的能力，确定其相关结构域，并通过晶体结构解析其结合H3K9甲基化的分子机制。再根据上述结果构建UHRF1和UHRF2丧失H3K9甲基化或D

24、NA甲基化或两者的点突变体。进而利用这些突变体分析H3K9甲基化和DNA甲基化识别能力，揭示它们在调控组蛋白修饰、DNA甲基化方面和核小体定位的作用和分子机制。2）构建UHRF1和UHRF2条件性敲除（conditional knockout）小鼠并获得UHRF1-/- 和UHRF2-/- ES细胞株。UHRF1和UHRF2条件性敲除小鼠将为今后研究分析UHRF1和UHRF2在胚胎发育后阶段，特别是与DNA甲基化异常相关疾病的研究创造有利条件。3）以野生型ES和UHRF1-/- 和UHRF2-/- ES细胞株为模型，制备单核小体染色质。运用UHRF1、UHRF2和各类组蛋白修饰特异抗体，通过染

25、色质免疫共沉淀结合高通量Solexa测序的方法（ChIP-Seq），并借助生物信息学分析手段，分析确定UHRF1和UHRF2在胚胎干细胞全基因组中的定位，进一步比较UHRF1/UHRF2、DNA甲基化、组蛋白修饰、核小体之间在基因组层次上的位置分布关系，揭示二者在组蛋白修饰、核小体重排和染色质重塑中的重要作用。总体的研究方案图示如下：甲基化组蛋白与甲基化DNA识别蛋白UHRF1和UHRF2全基因组UHRF1和UHRF2定位分析构建UHRF1和UHRF2敲除小鼠模型UHRF1-/-和UHRF2-/-胚胎干细胞或胚胎成纤维细胞与正常干细胞相比较分析UHRF1/UHRF2与组蛋白修饰、DNA甲基化、

26、核小体之间在基因组层次上的位置分布关系解析二者对H3K9甲基化和DNA甲基化的识别对组蛋白修饰、DNA甲基化的作用影响核小体重排、染色质重塑的分子机制结构功能分析鉴定二者对H3K9甲基化/DNA甲基化的识别能力比较野生型与突变体中，二者对组蛋白修饰和核小体定位的差异ICB90家族成员UHRF1和UHRF2蛋白是本部分的研究模型蛋白。目前的研究主要集中于UHRF1，而对UHRF2的功能知之甚少。ICBP90不仅能识别H3K9甲基化，而且还能识别DNA甲基化，是目前所知的唯一能同时识别甲基化组蛋白和甲基化DNA的蛋白因子。最近研究表明，ICB90/UHRF1在招募DNA甲基化酶DNMT1至新复制的

27、DNA链中起着至关重要的作用。但ICBP90在维持DNA甲基化中的作用及分子机制还未得到证明，有待进一步的研究。本课题通过小鼠基因敲除技术，从“组”学层次上研究UHRF1/UHRF2在调控胚胎干细胞表观遗传谱式中的作用，在课题设计和思路上具有很强的创新性。ICBP90/UHRF2是我们实验室通过生化方法鉴定出来的。因此本课题可行性很强，在国内外上都有很大的优势。另外，本课题的承担单位具有雄厚的硬件基础、杰出的科研人员、优秀的研究生生员，为本课题的顺利实施提供了保障。课题四 表观遗传组综合分析系统的构建和应用本课题主要开发高通量表观遗传组学数据的分析方法，建立数据中心、数据分析平台，解读表观遗传

28、在基因转录调控中的作用。为达到这些目标，我们相应地设计了如下研究方案：1. 表观遗传组的动态变化(1) 针对三种重要的模式生物（酵母、果蝇和人），收集在不同细胞分化阶段或细胞在不同外界刺激条件下的全基因组高通量核小体定位和组蛋白修饰的测序数据，并收集在相应条件下的转录组数据；(2) 将离散的高通量核小体定位测序数据转化为在基因组上连续的组蛋白密度分布信号，以隐马尔可夫模型（HMM）为核心算法，开发生物信息学工具，高通量鉴定特异性的组蛋白密度变化区域；(3) 开发生物信息学工具，以抽样法鉴定不同的测序深度造成的统计偏差并进行小样本矫正，从而高通量鉴定细胞状态特异性的核小体位置变化；(4) 结合在

29、相应条件下的转录组数据，初步探讨细胞状态特异性的组蛋白密度变化及核小体位置移动与基因的表达调控之间的关系；(5) 针对组蛋白共价修饰的高通量ChIP-Seq数据，特别是与基因表达抑制相关的组蛋白修饰（如H3K9me3、H3K27me3等），以隐马尔可夫模型为核心算法，开发生物信息学工具从基因组层次上鉴定细胞状态特异性的组蛋白差异修饰；(6) 针对与基因表达激活相关的组蛋白共价修饰（如H3K4me3、H2A.Z、H3K9ac等）,对于核小体解析度的ChIP-Seq数据，以贝叶斯反演（Bayesian Inversion）为核心算法，构建生物信息学模型定量化鉴定组蛋白修饰程度，并在此基础上定量鉴定

30、特异性的组蛋白差异修饰；(7) 结合在相应条件下的转录组数据，初步探讨细胞状态特异性的组蛋白差异修饰与基因的表达调控之间的关系。2. 表观遗传组分析平台(1) 在果蝇S2细胞系中准备四组标准测试样品，包括基因组DNA、核小体DNA、CTCF的ChIP样品、H3K36me3的ChIP样品和基因组对照样品；(2) 将四组样品分别用三种高通量测序仪Illumina/Solexa、SOLiD和Helicos进行深度测序；(3) 基于上述实验数据，进行生物信息学分析，包括：1)评估测序深度对检测灵敏度的影响，2)评估不同测序仪对数据质量的影响，3)监测不同信号峰检测软件的性能，4)建立ChIP-Seq数

31、据质量控制标准；(4) 将四组样品分别在Affymetrix全基因组高密度芯片上杂交；(5) 基于已完成的评估ChIP-chip数据质量的spike-in实验结果，以及上述实验数据，进行生物信息学分析，评估ChIP-chip和ChIP-Seq这两种技术平台对表观遗传数据检测灵敏度的影响；(6) 基于上述结果，整合我们针对不同技术平台发展出来的信号峰检测方法，包括MACS（ChIP-Seq数据）、NPS（核小体测序数据）、MAT（Affymetrix ChIP-chip数据）和MA2C（双色ChIP-chip数据），并加入数据质量控制标准，建立自动化流程来尽量消除不同表观遗传组学数据间因实验设计

32、和技术差别造成的影响；(7) 针对基于ChIP-chip或ChIP-Seq的表观遗传组学数据，建立和整合高通量数据分析方法，包括：1)我们上述提到的数据预处理自动化流程（包括信号峰检测软件和数据质量控制标准），2)在研究内容1中发展出的一系列高通量鉴定特异性的核小体定位变化和染色质差异修饰的方法，3)我们发展出来的下游分析方法，包括CEAS（功能注释）、SeqPos（检测富集的DNA序列基序（motif）等；(8) 在上述分析工具整合的基础上，依托计算服务器机群，运用软件工程技术，加入用户管理及数据可视化功能，建立表观遗传组学数据分析平台。3. 表观遗传组数据中心(1) 在丰富培养皿中分别培养

33、野生型酵母（S288C）和isw2基因敲除酵母，分别获得指数期正常培养条件、热休克条件（热休克15分钟）、半乳糖条件（加入2%半乳糖）下的酵母样品；(2) 针对每种酵母样品，用MNase酶降解核小体间连接DNA，然后利用ChIP-Seq技术，在核小体解析度上测量单核小体及如下几种组蛋白修饰，包括H3K4me3、H3K4me2、H2A.Z、H3K9ac、H3K36me3、H3K27me3、H3K9me3等；(3) 运用生物信息学方法，分析上述得到的相互关联的一系列表观遗传高通量数据，深入研究核小体重排和多种组蛋白修饰之间的相互影响；(4) 针对三种重要的模式生物（酵母、果蝇和人），收集和整合全基

34、因组核小体定位和组蛋白修饰的公共数据和本项目产生的数据，通过研究内容2中发展出的自动化流程来对数据进行预处理，包括统一数据检测的质量，并去除没有通过数据质量控制标准的数据，建立表观遗传组学数据中心。4. 表观遗传在调控网络中的作用(1) 针对三种重要的模式生物（酵母、果蝇和人），收集和整理转录因子高通量ChIP-chip和ChIP-Seq公共数据，在各个模式生物中建立基因调控网络，并整合基因组学、比较基因组学和细胞信号转导通路网络数据；(2) 基于本项目产生及收集的所有表观遗传组学数据，收集在相应条件下的模式生物转录组数据；(3) 基于研究内容3中产生的一系列相互关联的酵母高通量表观遗传数据，

35、结合酵母中由上百种转录因子ChIP-chip和ChIP-Seq公共数据建立的转录调控网络，以贝叶斯网络（Bayesian Network）为核心算法，建立生物信息学模型，在酵母中基本阐明核小体重排、组蛋白修饰和转录因子之间的相互作用，以及三者在基因转录调控网络中的协同功能；(4) 将上述分析方法应用于其它三种更为复杂的模式生物，结合转录调控网络，深入分析我们课题得到的所有数据和知识，特别是系统地分析本项目中果蝇、体细胞重编程、以及干细胞分化中的数据，从基因组层次上，较为全面地研究在不同细胞分化阶段，核小体重排和组蛋白修饰在真核基因转录调控网络中的重要作用。总体的研究方案图示如下：开发生物信息学

36、工具，从基因组层次上高效分析组蛋白密度变化、核小体位置变化以及组蛋白差异修饰整合表观遗传组数据分析工具软件工程和数据可视化技术深度测序表观遗传标准测试样品，阐明实验设计对表观遗传组数据质量的影响 系统地研究酵母中核小体重排和组蛋白修饰的基因转录调控作用结合文献挖掘技术，收集表观遗传学知识库表观遗传组数据分析平台表观遗传组数据中心表观遗传组综合分析系统构建生物信息学模型，从基因组层次上阐明核小体重排和组蛋白修饰在基因转录调控网络中的重要作用建立自动化流程，收集和整合表观遗传组学数据近期的高通量数据显示核小体重排和组蛋白修饰与基因的转录调控紧密相关，但是目前对其功能的研究仍很初步，而且从基因组层次

37、上分析和整合高通量数据已经成为表观遗传组学研究的瓶颈。本课题集中在研究、开发和整合高通量表观遗传组学数据分析方法，建立集数据中心和数据分析平台于一体的表观遗传组综合分析系统。同时，我们认为核小体重排及组蛋白修饰并非孤立地调控基因的表达，而是需要与转录因子相互影响，共同起作用。因此，基于表观遗传组综合分析系统，本课题重点研究核小体重排、组蛋白修饰和转录因子之间的相互作用，以及三者在基因转录调控网络中的协同功能。通过构建生物信息学模型从基因组层次上进行系统的研究，可以较为全面地揭示表观遗传在基因转录调控网络中的重要作用。本课题成果可以推动整个表观遗传组学领域的研究，具有重大价值和创新性。本课题是在

38、已有工作基础上的进一步深化和扩展，研究内容都是基于我们在针对高通量表观遗传组学数据已有的工作基础上所提出的重要问题。本课题的主要研究人员在分析和整合高通量数据方面在国际上具有领先的地位，已经掌握研究方案和技术途径中所涉及的方法和技术，包括：生物信息学技术、ChIP-Seq技术、分子生物学技术、数据库技术、软件工程技术、数据可视化技术等。同时，承担单位具有高效的管理系统、专业的技术支持系统、优秀的研究生生源。因此，本研究方案是完全可行的。各课题间相互关系本项目设置四个课题，从胚胎发育、体细胞核移植和iPS细胞形成、干细胞分化和表观遗传组学四个方向研究核小体重排和染色质重塑。这四个课题各有侧重，同

39、时互为补充，从不同角度，多学科结合在一起，全面深入地阐述核小体重排和染色质重塑及组蛋白修饰在胚胎发育、体细胞重编程和干细胞分化及在基因转录调控中的重要功能和作用机制。课题一、果蝇胚胎发育中的核小体重排和染色质高级结构的变化研究目标：构建果蝇重要发育阶段及重要基因突变体的高分辨率全基因组核小体图谱，探索不同发育阶段和突变体中核小体重排及染色质结构的变化，阐明核小体重排和染色质结构变化的内在规律，以及与胚胎发育间的关联，影响胚胎发育与造成胚胎发育缺陷的分子作用机理。同时，建立一套稳定的可应用于不同物种的绘制高分辨率核小体图谱的方法。研究内容：在果蝇发育中两个典型的时间点，分离出染色质，通过染色质免

40、疫沉淀耦联测序的技术，构建高分辨率核小体图谱。通过比较基因组学的手段，揭示在不同发育阶段核小体重排和染色质结构的变化，鉴定作为指引核小体定位基础的保守DNA序列及其特征。同时阐述组蛋白修饰对核小体重排和染色质重塑的作用机制 。此外，利用类似的方法，构建果蝇 brm突变体的高分辨率核小体图谱，分析靶基因的核小体重排和染色质结构的变化，并阐明它们对胚胎发育缺陷的作用机制。再利用基因剔除实验或RNAi干扰技术分析证实这些靶基因在胚胎发育过程的分子作用。经费比例： 27%承担单位： 同济大学课题负责人： 江赐忠课题二、体细胞重编程过程中核小体重排和染色质重塑研究目标：阐明iPS细胞诱导过程中组蛋白修饰

41、特异性变化、核小体重排、染色质重塑和基因转录特异性激活或抑制间的相互作用、因果关系和调节机制，找出在这一细胞重编程过程中起关键作用的未知因子及其分子机理。通过体细胞核移植的研究以及卵母细胞定量质谱分析阐明核移植重编程与iPS重编程的机制是否相同，卵母细胞中可能的重编程因子是否可以为iPS细胞诱导所利用进一步提高iPS诱导效率。研究内容：研究在体细胞核移植和iPS细胞形成等体细胞重编程中组蛋白修饰特异性改变、核小体重排和染色质重塑，揭示它们在调节体细胞重编程中的互动网络和机制。研究体细胞重编程中关键分子和信号通路的激活剂和抑制剂对组蛋白修饰特异性和染色质重塑相关分子的调节作用及机制，以及这些小分

42、子化合物在iPS细胞形成中的作用及机制。经费比例： 25%承担单位： 北京生命科学研究所、同济大学课题负责人： 高绍荣课题三、胚胎干细胞中组蛋白修饰、DNA甲基化和核小体定位的互动机制研究目标：胚胎干细胞中DNA甲基化和组蛋白修饰与核小体重排的关系；组蛋白修饰识别蛋白调控组蛋白修饰和影响核小体重排的作用机制，组蛋白修饰识别蛋白调控胚胎干细胞全能性和分化的分子机制。并利用UHRF1和UHRF2敲除小鼠胚胎干细胞为模型，研究组蛋白修饰和DNA甲基化之间的互动及其在基因组水平上对核小体定位的影响。研究内容：以小鼠胚胎干细胞为模型，通过对组蛋白修饰识别蛋白ICBP90家庭成员UHRF1和 UHRF2的

43、研究，获得二者的全基因组定位，阐明二者的定位与所在位点的组蛋白H3K9甲基化和DNA甲基化的关系。并以此为模型分析组蛋白修饰识别蛋白影响DNA甲基化、组蛋白修饰和核小体重排的机制，及三者之间的互动关系和具体每一个活动（activity）对胚胎干细胞特性的维持和分化的影响。经费比例： 23%承担单位： 华东师范大学、中国科学院生物物理研究所课题负责人： 翁杰敏课题四、表观遗传组综合分析系统的构建和应用研究目标：构建表观遗传组综合分析系统，建立高通量数据质量控制标准，阐明核小体重排、组蛋白修饰与转录因子之间的相互作用，及三者在基因转录调控网络中的协同功能。研究内容： 在基因组层次上如何分析、整合及

44、阐释高通量数据已经成为表观遗传组学研究的瓶颈，本课题拟开发高通量鉴定组蛋白修饰差异和核小体定位变化的分析工具，并深入研究高通量数据的质量控制，建立表观遗传组学分析平台；同时收集和整合全基因组核小体图谱和组蛋白修饰的公共数据和本项目中产生的数据，并整合基因组学、比较基因组学和细胞信号转导通路数据，建立表观遗传组学数据中心。以此为基础，系统地分析项目中果蝇、体细胞重编程、以及干细胞分化中的数据，研究核小体重排、组蛋白修饰与转录因子之间的相互作用，及三者在基因转录调控网络中的功能。经费比例： 25%承担单位： 同济大学课题负责人： 张勇四、年度计划研究内容预期目标第一年收集果蝇原肠形成期的胚胎，分离

45、、制备单核小体，并测出其序列，定位到基因组，绘制出高分辨率全基因组核小体图谱。iPS细胞诱导技术的建立，为进一步研究iPS细胞形成机制打下基础；iPS四倍体小鼠的建立，将为不同组织来源iPS细胞系的构建提供便利，而且这样来源的组织细胞遗传背景、外源因子插入的拷贝数等都具有可比性。开展UHRF1和UHRF2识别H3K9甲基化的结构和功能研究，开展UHRF1和UHRF2敲除小鼠的打靶载体的构建和初期干细胞同源重组工作，制备和鉴定染色质免疫共沉淀级UHRF1和UHRF2抗体，以便进行通过ChIP-Seq进行UHRF1和UHRF2在小鼠胚胎干细胞基因组中定位。针对高通量核小体测序数据，发展生物信息学分

46、析手段；在果蝇S2细胞系中准备ChIP标准测试样品;针对组蛋白修饰高通量ChIP-Seq数据，建立生物信息学模型。获得果蝇原肠形成期胚胎的高分辨率全基因组核小体图谱；建立一套稳定可行的适用于不同物种的高分辨率全基因组核小体图谱绘制方法。建立Tet-on可诱导iPS细胞系统；培育出可诱导iPS四倍体互补小鼠。基本完成对UHRF1和UHRF2的H3K9甲基化识别区域的结构鉴定；实现UHRF1或UHRF2 H3K9识别结构域的高表达和纯化；初步完成UHRF1和UHRF2敲除小鼠的打靶载体的构建；鉴定出1-2 个ChIP级的UHRF1和UHRF2抗体。预计可以建立高通量鉴定组蛋白密度变化、核小体位置移

47、动的方法；预计可以获得核小体定位和组蛋白修饰的标准测试样品；预计可以高通量、定量化地鉴定特异性的组蛋白差异修饰。第二年收集果蝇神经分化形成期的胚胎，分离、制备单核小体，并测出其序列，定位到基因组，绘制出高分辨率全基因组核小体图谱；比较原肠形成期与神经分化形成期胚胎中核小体定位的变化，研究核小体重排和染色质结构的变化在胚胎发育中的作用机理。克隆胚胎内细胞团及iPS细胞的核小体定位的异同，揭示核小体重排和染色质重塑在维护干细胞全能性和iPS细胞诱导后多能性获得中的作用及机制。继续研究UHRF1和UHRF2识别H3K9甲基化的分子机制，研究其识别H3K9甲基化的生物学意义，与其识别DNA甲基化的功能

48、关系；开展UHRF1和UHRF2在小鼠胚胎干细胞全基因组的ChIP-seq定位研究；继续进行UHRF1和UHRF2敲除小鼠的建立工作。对核小体定位和组蛋白修饰的标准测试样品分别在不同高通量测序平台进行深度测序实验；建立自动化流程来消除不同表观遗传组学数据间因实验设计和技术差别造成的影响；培养野生型和isw2基因敲除酵母，分别获得指数期正常培养条件、热休克条件、半乳糖条件下的酵母样品。获得果蝇神经分化形成期胚胎的高分辨率全基因组核小体图谱；揭示核小体重排和染色质结构在不同发育时期的变化本质规律，及在胚胎发育中的作用机理。克隆胚胎内细胞团及iPS细胞的全基因组核小体图谱，分析鉴定在维护干细胞全能性

49、和iPS细胞诱导后多能性获得中所需的特定核小体定位和基因组区域。基本阐明UHRF1和UHRF2识别H3K9甲基化的分子机制，基本阐明其识别H3K9甲基化功能与识别DNA甲基化功能的关系，以及这两者与细胞内DNA甲基化的建立与维持的关系；获得UHRF1和UHRF2在小鼠胚胎干细胞全基因组定位谱；希望获得UHRF1和UHRF2敲除小鼠。预计可以阐明ChIP-Seq实验设计对表观遗传组学数据质量的影响；预计可以消除因实验设计和技术差别对表观遗传组学数据造成的影响；预计可以为进行核小体解析度的ChIP准备好每种条件下的酵母样品。第三年分别绘制野生型和brm突变体果蝇的高分辨率全基因组核小体图谱；比较二

50、者的异同，发现核小体定位的变化；探索核小体重排和染色质结构变化在胚胎正常和缺陷发育中的作用机制。分析组蛋白特异性修饰（主要是H3K4和H3K9的甲基化以及H3K4的乙酰化）在iPS细胞形成中的作用与机制，以及对核小体重排和染色质重塑的调控功能。解析UHRF1和UHRF2识别H3K9甲基化的分子结构，研究其识别H3K9甲基化活性与细胞内DNA甲基化，特别是异染色质区域DNA甲基化的建立与维持的关系；继续进行UHRF1和UHRF2在小鼠胚胎干细胞全基因组的ChIP-seq定位研究；研究UHRF1和UHRF2条件性敲除小鼠的表型性状，特别是在胚胎发育中的作用与机制；获得UHRF1和UHRF2敲除小鼠胚胎干细胞，开展全基因组的核小体定位，DNA甲基化与组蛋白修饰的研究。以标准测试品深度测序试验为基础，建立和整合高通量表观遗传组学数据分析方法，依托高性能计算服务器，并整合软件工程和数据可视化技术，建立表观遗传组学数据分析平台；运用ChIP-Seq技术在核小体解析度上测量酵母在各种条件下单核小体及几种重要的组蛋白修饰。获得野生型和brm突变体果蝇的高分辨率全基因组核小体图谱；揭示核小体定位在胚胎发育缺陷中的作用机理。获得H3K4和H3K9的甲基化以及H3K4的乙酰化的全基因组位点图谱，揭示它们之间的关联关系；比照核小体图谱，阐明它们对核小体重排和染色质重塑的调控机制。基本确定