2020年(生物科技行业)分子生物学实验指导

1、（生物科技行业）分子生物学实验指导20XX年XX月多年的企业咨询豉问经验.经过实战验证可以落地机行的卓越管理方案，值得您下载拥有分子生物学实验指导动植物检疫专业2012 ， 2分子生物学实验注意事项1 课前要提前预习实验内容，了解实验设计的原理，理清实验顺序，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作） 。2 由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，壹定要做好统筹安排。3 实验课中的所有单项实验都属于壹个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，壹切服从实验进度，必须在理论课上课期间完成。4 实验的每壹步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！

2、5 对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！ ） 。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。6 写作实验报告或实验论文壹定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻。7 在实验室内不能大声喧哗。8 在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面壹角） ，严禁随地丢弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。9 实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐且清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。10 值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。11 实验时损坏的任何物品都要及时申报。实验壹质粒DNA 的提取12 目

3、的学会最常用的小量制备质粒 DNA 的碱裂解方法。13 原理根据共价闭合环状质粒 DNA 和线性 DNA 在拓扑学上的差异来分离。在 pH12.0 12.5 这个狭窄的范围内，线性DNA 双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒 DNA 也会变性，但俩条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在壹起。当加入 pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH 恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA 复性快，而线性的染色体DNA 复性缓慢，经过离心和蛋白质和大分子RNA 壹起沉淀下去。14 器材1.5ml 微超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器， 量离心管，恒温摇床，摇菌试管

4、，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。15 试剂pMD18-T-F 载体菌， LB 培养基 1000ml （含 100ug/ml 氨苄青霉素） ，葡萄糖 /Tris/EDTA（GTE） 溶液（溶液I） ， NaOH/SDS 溶液 （溶液 II） ， KAc 溶液（ pH4.8 ） （溶液 III） ，RNaseA ， 95% 乙醇， 70% 乙醇， TEbuffer （ pH8.0 ） 。16 实验准备氨苄青霉素储存液（无菌水配制 5mg/ml ，分装后 -20 C 保存） ，配制 LB 培养基（胰化蛋白胨 10g ， 酵母提取物 5g ， NaCl10g 加 200mLddwate

5、r 搅拌完全溶解， 用约 200 L5NNaOH 调 pH 至 7.0 ，加 ddwater 至 1L ， 121 C20min 灭菌） ；溶液 I （50mmol/L 葡萄糖， 25mmol/LTrisHClpH8.0 ， 10mmol/LEDTApH8.0 ） ；溶液 II （ 0.2mol/LNaOH ， 1%SDS ） ； 溶液 III（ 60mL5mol/LKac ， 加冰乙酸调pH4.8 ， 补 ddwater 至 100ml ） ， 70% 乙醇 （-20 C保存） ， TEbuffer （ 10mmol/LTrisHClpH8.0 ， 1mmol/LEDTApH8.0 ） ；

6、10mg/mLRNaseA（ RNA 酶 A 溶于 10mmol/LTrisHClpH7.5 ， 15mmol/LNaCl 中） ；摇菌试管洗净且盖上棉花塞、 1.5ml 离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒， 壹起高压灭菌 （ 121 C30min ） 。17 操作步骤（ 1 ）在超净工作台中取5mlLB （ Amp + ） ，加入灭菌的摇菌管中。（ 2）从超低温冰箱中取出保存pMD-18T-F 的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！ ） ，在超净工作台上用烧红的接种环刮壹下，再把接种环于无菌 LB 培 养液（含 100ug/ml 氨苄青霉素）中搅拌壹下， 3

7、7 C 摇床中摇 20h 。（ 3） 取 1.5ml 的菌液于 1.5ml 离心管中， 15000rpm 离心 1min ， 弃上清液 （尽量弃干净） ， 留沉淀备用。（4）在沉淀中加入 100 l溶液I,盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置 5min。（等待的同时，取壹个塑料盒，装上适量的冰块备用。 ）（ 5）加入 200 l 溶液 II ，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min 。（6）加入 150 l 溶液 III ，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min 。（ 7） 15000rpm 离心 5min ，小心吸取400 l 上清液于另壹个干净的 1.5ml 离心

8、管中， （不要将白色沉淀物带入！ ） ，加入 800 l95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下 静置 5min 。（ 8） 15000rpm 离心 10min ，小心弃掉上清液，加入 500 l70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。 15000rpm 离心 10min ，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净（ 9） 再加入 500 l70% 乙醇， 盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。 15000rpm 离心 10min ， 小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净（10）离心管倒置于37 C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒 DNA用肉眼几乎见不见！ ） 。（ 11 ） pMD1

9、8-T-F 加入 30 l 无菌蒸馏水或TE 缓冲液，用记号笔标记后放入冰箱中备用。（12 ）在剩余的菌液中倒入少许84 消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块壹起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告7 思考（ 1 ）影响本实验结果的因素有哪些？实验二、质粒DNA 的酶切1 目的学会用限制性内切酶切割质粒 DNA 。2 原理II 型限制性内切酶能识别双链DNA 内部的特殊序列且在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的 DNA 混合物能够确认和分离酶切片段。3 器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头， 1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴

10、。4 试剂pMD18-T-F 质粒，EcoRI, BamHI ,内切酶缓冲液（10 x）, 10 x电泳加样缓冲液5 实验准备配制 TAE 电泳缓冲液（ 50 储存液） ， 1000 溴化乙锭储存液（ 0.5mg/ml ） ， 10 加样缓冲液，1.5ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）6 操作步骤（ 1 ）混合下列溶液于壹个无菌的1.5ml 微量离心管中：pMD18-T-FDNA（或 pUCm-T-F）6 510 X酶切缓冲液（用 EcoRI的缓冲液）2 dLddwater30 科 LEcoRIIBamHII总体积40 L（ 2 ）先准备壹个冰盒且放入壹定量的

11、冰块。从-20 冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。（ 3 ）用壹只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温） ，另壹只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 wL限制性内切酶。（ 4 ）在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！ ） ，轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中 1000rpm 离心 10 秒。取出后插到水漂的孔中，在推荐的最适酶切温度水浴中温育1-3h （壹般是 37 ） 。（ 5 ）酶切后取少量酶切产物和合适的已知分子量的 DNA （如先前的 PCR 产物）对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。（ 6 ）酶切后的质粒能

12、够回收备用。（ 7 ）清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验报告。7 思考（ 1 ）酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？（ 2 ）如何估计DNA 用量和酶的用量？(3)在吸取内切酶的时候如何操作才能别免浪费?实验三、质粒DNA的PCR扩增1 .目的学会PCR操作的基本技术。2 .原理是将待扩增的DNA模板加热变性，和其俩侧互补的寡聚核甘酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下壹轮变性一复性一延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增(1+X)叱言。其中25nt的引物退火温度 Tm=2 (A+T ) +4 (G+C)。3 .器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml

13、PCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。4 .试齐IJ3U/ 科 ITaqDNA聚合酶，PCR 缓冲?夜(10X, MgCl 2free ), 25mMMgCl 2, dNTP，引物， 模板质粒 pMD18-T-F ,无菌ddwater 。5 .实验准备dNTP混合液(每种25mM ), TAE电泳缓冲液，1000澳化乙锭储存液(0.5mg/ml ), 10加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)。合成的引物：Senseprimer5'-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-

14、3'Antisenseprimer5'-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3'目的基因模板质粒：已经克隆在pMD18-T-F 载体上的781bpNDV-F 基因。待扩增的F片段长度：837bp 。6 .操作步骤(1)在0.2mlPCR微量离心管中配制 50科反应体系。ddwater32 科 110 xPCRbuffer (不含 MgCl 2) 5 口25mMMgCl 23 口2.5mmol/LdNTP4 科 l (每dNTP 终浓度 0.2mM )10mol/LPrimer12 12.5 十 25pmoles )10(imol/Lprimer22

15、 (12.5 25pmoles )模板质粒 1(1 X10-3pmoles )3U/ /Taq 酶 1 / (3u)总体积50 /(2)根据厂商的操作手册设置 PCR仪的循环程序： 94 C5min 94 C 1min 60 C 1min 72 C 1min50s goto 29times 72 C 10min（3） PCR结束后，取10科产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。 （ 4 ）清理桌面，撰写实验报告。7 思考（ 1 ）复性温度如何确定？（ 2 ）为什么要在最后延伸 10min ？（ 3 ）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体） ，如何才能消除？实验四、 DNA 电

16、泳鉴定1 目的学会常用的 DNA 琼脂糖凝胶电泳、 。2 原理DNA 双螺旋分子骨架俩侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的 DNA 由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。3 器材电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块， 250ml 三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器， 1.5ml 离心管，双面微量离心 管架，试管架等。4 试剂pMD18-T-F 载体， TAE 电泳缓冲液， 1000 溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉， 10 加样缓冲液（或 6 加样缓冲液） ， DNA 分子量标准（ DNAHindIII:

17、23130 ， 9420 ， 6560 ， 4360 ， 2320 ， 2030 ， 560 ， 130bp ） 。5 实验准备配制 TAE 电泳缓冲液（ 50 储存液， pH 约 8.5 ： Tris 碱 242g ， 57.1ml 冰乙酸，37.2gNa 2EDTA.2H 2O ， ddwater 定容至 1L） ， 1000 溴化乙锭储存液（ 0.5mg/ml ： 50mg 溴化乙锭溶于100mLddwater ， 4 C 避光储存） ， 10 加样缓冲液（ 20%Ficoll400 ，0.1mol/LNa 2EDTApH8.0 ， 1.0%SDS ， 0.25% 溴酚蓝） ； 6 加样

18、缓冲液（ 0.25% 溴酚蓝， 40%蔗糖水溶液） ； 1.5ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌） 、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌） 。6 操作步骤（ 1 ）称取 0.5g 琼脂糖粉，放入三角瓶，加入 50mlTAE 电泳缓冲液（1 ） ，放入微波炉中烧开（ 1min ） 。 50ml 正好倒俩块小胶。（ 2 ）注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！ ） 。（ 3 ）戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约 50-60 C ） 。（ 4 ）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至和模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10-20 分钟待胶完全凝固。 （剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用） 。（ 5 ）在水平电泳槽中加满1 TAE 电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V（10V/cm） ，注意正负电极的位置连接正确。（ 6 ）待胶完全凝固后（ 15-20 分钟） ，小心拔出梳子。用手指捏住模具俩