寡聚半乳糖醛酸对云南

1、1寡寡聚半乳糖醛酸对云南红豆杉细胞悬聚半乳糖醛酸对云南红豆杉细胞悬浮培养中紫杉醇及浮培养中紫杉醇及10-10-去乙酰基巴卡亭去乙酰基巴卡亭生物合成的影响生物合成的影响 专 业：生物制药 作 者：许栋华 指导老师：王剑文 副研究员2背景简介 紫杉醇紫杉醇(taxol) 作为一种作用机制独特的植源性抗癌新药。但由于紫杉醇天然含量很低，加上资源本身亦非常贫乏，因此限制了紫杉醇的进一步开发和应用。为了解决其药源问题，科学家在寻找及扩大紫杉醇药源途径上（如筛选高产量红豆杉栽培品种、化学合成、生物技术及微生物中生产等）进行了艰苦的研究工作。近年来，细胞培养技术已成为对红豆杉属植物研究的重要手段。 10-去

2、乙酰基巴卡亭去乙酰基巴卡亭 （10-deacetyl baccatin ，10-DAB ） 是紫杉醇生物合成的重要前体物质，本身亦有抗癌活性。法国研究小组发现10-DAB 可从欧洲红豆杉的针叶中提取，其产率可达0.1%，10-DAB 的发现为通过连接紫杉醇侧链半合成紫杉醇提供了较佳方法。迄今已在数种红豆杉属植物中分离到该成分。它不仅来源广泛，而且提取的效率也较高，是一种较易检测及广阔开发前景的紫杉烷类物质。 寡聚半乳糖醛酸（寡聚半乳糖醛酸（OGA）为果胶的不完全酶解产物，其单体半乳糖醛酸是组成植物细胞壁中果胶质的主要成分，参与细胞壁复杂网架的形成。以OGA为诱导物，可诱导多种植物（如拟南芥、番

3、茄、胡萝卜、马铃薯等）产生抗性反应，促进人参细胞中有效次生代谢产物人参皂苷的合成，本实验测定结果可见，OGA可显著提高云南红豆杉细胞中10-DAB 及紫杉醇的含量。3第一部分第一部分 云南红豆杉悬浮培养细胞生长云南红豆杉悬浮培养细胞生长周期内紫杉醇及周期内紫杉醇及10-去乙酰基巴卡亭去乙酰基巴卡亭含含量的变化量的变化第二部分第二部分 寡聚半乳糖醛酸诱导云南红豆寡聚半乳糖醛酸诱导云南红豆杉悬浮培养细胞最佳浓度的筛选杉悬浮培养细胞最佳浓度的筛选第三部分第三部分 寡聚半乳糖醛酸诱导云南红豆寡聚半乳糖醛酸诱导云南红豆杉悬浮培养细胞最佳收获时间的筛选杉悬浮培养细胞最佳收获时间的筛选4第一部分第一部分 云

4、南红豆杉悬浮培养细胞生云南红豆杉悬浮培养细胞生长周期内长周期内Taxol及及10-DAB 含量的变化含量的变化51 材料与方法材料与方法1). 云南红豆杉细胞的培养云南红豆杉细胞的培养 研究用的细胞系是经多次继代培养的云南红豆杉（T. yunnanensis）细胞株。在改良的MS固体培养基上继代培养。将生长良好的细胞3 g 转入含30 mL MS液体培养基的150 mL三角瓶中，25，110 r/min黑暗振荡培养。2). 红豆杉细胞的处理红豆杉细胞的处理 本实验将云南红豆杉细胞悬浮培养，分别于接种后第0、1、4、7、10、13、16、19、22 d 收获细胞，提取紫杉醇及10-DAB ，HP

5、LC法检测其含量，每种处理3个重复，共8组。3). 紫杉醇及紫杉醇及10-DAB 的含量分析的含量分析 色谱条件：10-DAB 含量测定：色谱柱（Restek C18柱：150 mm2.1 mm，5 m），流动相为甲醇-乙腈-水（2：3：8），检测波长为232 nm，流速为0.2 mL/min，柱温为35，进样量为10 L。 Taxol含量测定：色谱柱（Restek C18柱：150 mm2.1 mm，5 m），流动相为甲醇-乙腈-水（25：35：45），检测波长为227 nm，流速为0.2 mL/min，柱温为35，进样量为10 ml。6M in u te s051 01 52 0m A U

6、01 02 0M in utes0510152 0m A U01020 图图 1 10-DAB 及及紫紫杉杉醇醇标标准准品品及及样样品品色色谱谱图图 （*：10-DAB ；*：紫杉醇） * * M in u te s024681 0m A U01 0 02 0 0M in u te s024681 0m A U02 04 0 * * * 2 结果与讨论结果与讨论70.000.050.100.150.200.250.300.350.4001471013161922生长天数 d干重 g10-DAB含量 mg/g DW0.00.51.01.52.02.510-DAB产量 mg/L干重 g含量 mg/

7、g产量 mg/L 0.000.050.100.150.200.250.300.3501471013161922生长天数 d干重 g紫杉醇总产量 mg/L0.000.010.020.030.04紫杉醇含量 mg/g.DW干重总产量含量 图图 2 10-DAB 及及紫紫杉杉醇醇生生长长周周期期内内含含量量 8第二部分第二部分 寡聚半乳糖醛酸（寡聚半乳糖醛酸（OGA）诱导）诱导云南红豆杉悬浮培养细胞浓度的筛选云南红豆杉悬浮培养细胞浓度的筛选91 材料与方法材料与方法1) 红豆杉细胞的培养红豆杉细胞的培养（见第一部分1.1.1）2 )OGA诱导子的制备诱导子的制备多聚半乳糖醛酸经果胶酶室温下裂解20m

8、in，过滤，浓缩后冻干成粗OGA粉末。将OGA粉末配成1 g/L溶液，经Sephdex G-10 柱处理滤除MW700的寡聚物，所得溶液浓缩后用0.45 m微孔滤膜过滤除菌，作为OGA诱导子备用。3 )红豆杉细胞的诱导处理红豆杉细胞的诱导处理 本实验将培养的云南红豆杉细胞分成对照组及处理组，处理组设4种不同诱导子浓度，分别为20、40、60、80 g/mL，对照组加入同量双蒸水。每种处理4瓶，共4个重复。细胞培养至第17天加入OGA，继续培养至第24天收获。4 )10-DAB及紫杉醇的含量分析及紫杉醇的含量分析（见第一部分1.1.3）100.00.10.20.30.4020406080诱导子浓

9、度 mg/L干重 g10-DAB 含量 mg /g DW0.0000.0050.0100.0150.0200.025紫杉醇含量 mg/ g DW10-DAB干重紫杉醇 图图 4 不同浓度不同浓度 OGA 对对 10-DAB 及紫杉醇生物合成的影响及紫杉醇生物合成的影响 2 结果与讨论结果与讨论11第三部分第三部分 寡聚半乳糖醛酸（寡聚半乳糖醛酸（OGA）诱导云）诱导云南红豆杉悬浮培养细胞最佳收获时间的筛选南红豆杉悬浮培养细胞最佳收获时间的筛选121 材料与方法材料与方法1). 红豆杉细胞的培养红豆杉细胞的培养（见第一部分1.1.1）2 ). OGA诱导子的制备诱导子的制备（见第二部分1.1.2

10、）3 ). 红豆杉细胞的处理红豆杉细胞的处理 本实验将云南红豆杉细胞悬浮培养至第13 d加入诱导子OGA（40 mg/mL），25，110 r/min黑暗振荡培养，分别于处理后第0、2、4、6、8 d收获细胞，提取紫杉醇及10-DAB ，HPLC法检测其含量，每种处理3个重复，共5组。4 ). 紫杉醇及紫杉醇及10-DAB 的含量分析的含量分析（见第一部分1.1.3）13Minutes05101520m A U01020Minutes05101520m A U01020 M inutes05101520m A U01020M inutes05101520m A U01020 图图 5 经经 O

11、GA 处处 理理 后后 10-DAB 及及 紫紫 杉杉 醇醇 色色 谱谱 图图 （ *： 10-DAB ； *： 紫 杉 醇 ） * 2 结果与讨论结果与讨论 140.000.050.100.150.200.250.300.3502468生 长 天 数 d干重g10-DAB总产量mg/L0.0000.0050.0100.0150.02010-DAB含量mg/g DW干 重总 产 量含 量0.000.050.100.150.200.250.300.3502468生 长 天 数 d干重 g紫杉醇 含量mg/g DW00.10.20.30.40.50.60.70.80.9紫杉醇总产量 mg/L干 重含 量总 产 量 图图 6 经经 O G A 处处 理理 后后 10-DAB 及及 紫