hiv感染的血清学检测ppt课件

1、 HIV感染的血清学检测感染的血清学检测内容nHIV抗体检测：抗体检测：nHIV抗体筛查检测抗体筛查检测nHIV确认实验确认实验nHIV P24抗原检测：抗原检测：HIVHIV抗体检测抗体检测全国艾滋病检测技术规范National Guideline for Detection of HIV/AIDS2004年版nHIVHIV抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查：抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查：n以监测为目的的检测是为了解不同人群以监测为目的的检测是为了解不同人群HIVHIV感染率及其变感染率及其变化趋势而进展的检测，检测的人群包括各类高危人群和化趋势而进展的检测，检测的人群包括各类高危人群

2、和普通人群。普通人群。n以诊断为目的的检测是为了确定个体以诊断为目的的检测是为了确定个体HIVHIV感染情况而进展感染情况而进展的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需求进展的体检等。据特殊需求进展的体检等。n以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIVHIV而进展而进展的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。nHIVHIV抗体检测分为筛查实验包括初筛和复检和确认实抗体检测分为筛查实验包括初筛和复检和确认实验验HIV抗体试剂盒进展代次代次 抗原抗原 方法

3、方法特异性检测特异性检测 检测时间检测时间1 全病毒全病毒 间接间接 IgG 抗体抗体HIV-1 2个月个月2 重组或多肽重组或多肽 间接间接 IgG 抗体抗体HIV-1 / -2 3-4 周周3 重组重组+多肽多肽 夹心夹心 IgM / IgG 抗体抗体 4-7 天天 HIV-1 / -2 / -O4 抗原抗原+抗体抗体 夹心夹心IgM / IgG 抗体抗体 抗原抗原 5pg HIV-1 / -2 / -O p24 抗原抗原 HIV抗体检测筛查实验HIV抗体筛查检测n程序筛查、复检、确认n原理酶联免疫、凝集、层析n标本血液、唾液、尿液、组织液n产品ELISA、快速、简单筛查试剂要求nHIV

4、混合型n国家SDA生物诊断试剂注册同意n批检合格n临床评价质量优良筛查方法：筛查方法：常用的筛查方法是酶联免疫实验常用的筛查方法是酶联免疫实验ELISAELISA快速检测快速检测RTRT及其它检测及其它检测 (1) (1)明胶颗粒凝集实验明胶颗粒凝集实验(PA)(PA) (2) (2)斑点斑点EIAEIA或称斑点或称斑点ELISA ELISA (dot-EIA)(dot-EIA) (3) (3)斑点免疫胶体金或胶体斑点免疫胶体金或胶体硒快速实验硒快速实验 (4) (4)艾滋病唾液检测卡艾滋病唾液检测卡尿液尿液HIVHIV抗体检测抗体检测一、酶联免疫实验：ELISA 包被抗原血中抗体与抗原反响显

5、色反响酶联免疫法酶联免疫法病毒溶解抗原、重组的衍生抗原、合成肽抗原酶联HRP、AP或化学发光一斑点EIA或称斑点ELISAdot-EIA以硝酸纤维膜为载体，将HIV抗原滴在膜上成点状，即为固相抗原。加血清样品作用，以后步骤同ELISA。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反响时间在10 min以内，运用抗原量少。二、快速诊断试剂二、快速诊断试剂二免疫胶体金或胶体硒快速实验与斑点EIA类似，也是以硝酸纤维膜为载体。区别在于不用酶标志抗体，而代之以红色的胶体金或胶体硒A蛋白，用渗滤法作为洗涤方法。n稳定，可室温长期保管。实验不需任何设备，稳定，可室温长期保管。实验不需任何设备，迅速、简便、特异性

6、较好，敏感性约相当于迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的中度敏感的ELISAELISA，适用于应急检测、门诊，适用于应急检测、门诊急诊个体检测。急诊个体检测。n已有被已有被SFDASFDA同意注册的进口试剂和国内产品。同意注册的进口试剂和国内产品。普通可在普通可在101030min30min内判读结果。内判读结果。 免疫胶体硒快速实验特点免疫胶体硒快速实验特点v样品垫: 参与血浆,血清或全血样品.红细胞在此迁移过程中被去除v质控条:固定的含捕捉硒标物的特异性试剂,不论样品中有无被检测物都应出现红色线条.控制测试结果的有效性病人条:固定的含特异性分析试剂,任何与硒标特异性试剂结合的分

7、析复合物在此被结合固定,构成三文治结合物,肉眼可见的红色线条阐明有阳性反响衔接物垫:含分析特异性试剂结合的硒标,为一种肉眼可见的红色信号,被分析物和硒标特异性试剂在此反响结合 撕下所需的测试纸条数,撕下外表维护膜血清/血浆样品加50ul样品于样品垫中15分钟内读取结果全血样品 加50ul样品于样品垫中手指血方法静脉血方法加一滴缓冲液15分钟内读取结果病人条质控条 本卷须知n非EDTA抗凝的血浆样品能够会n 得到不正确的结果n反响条颜色深浅的程度与样品中n 抗体的滴度没有必然的联络 n结果的判别n 三艾滋病唾液检测卡在硝酸纤维膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同时检测含在唾液

8、中的HIV-1/HIV-2抗体，原理为酶免疫间接法。主要检测唾液中的HIV IgA与IgG抗体，敏感性特异性与ELISA相近，可防止静脉穿刺。但样品预处置时间长且售价较高。以唾液为样品测定HIV抗体的ELISA、免疫印迹法WB试剂曾经美国FDA同意。四明胶颗粒凝集实验PAPA是HIV血清抗体检测的一种简便方法，是将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温普通为室温。当待检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反响，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA试剂有两种，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂AFD HIV-1/2 PA，曾经我国食品

9、药品监视管理局SFDA注册同意；HIV-1、HIV-2抗原分别致敏的PA试剂SERODIA-HIV-1/2可初步区分HIV-1型和HIV-2型，目前我国尚未引进。 尿液测定采样优点，尤其对吸毒者标本机理：IgA为主，IgG少量HIV-1型抗体阳性结果务必用血清学检测快速试剂的运用n偏远地域n急诊n临床高危n职业暴露n临产结果报告：结果报告： 对呈阴性反响的样品，可由实施检测的实验室对呈阴性反响的样品，可由实施检测的实验室出具出具HIVHIV抗体阴性报告。抗体阴性报告。 对呈阳性反响的样品，须进展复检，不能出阳对呈阳性反响的样品，须进展复检，不能出阳性报告。性报告。复检实验：复检实验： 对初筛呈

10、阳性反响的样品用原有试剂和另外一对初筛呈阳性反响的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂反复检测。种不同原理或不同厂家的筛查试剂反复检测。 假设两种试剂复测均呈阴性反响，那么报告假设两种试剂复测均呈阴性反响，那么报告HIVHIV抗体阴性；如均呈阳性反响，或一阴一阳，需抗体阴性；如均呈阳性反响，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进展确认。送艾滋病确认实验室进展确认。 对初筛实验呈阳性反响者不能出阳性报告，可对初筛实验呈阳性反响者不能出阳性报告，可出具出具“HIVHIV抗体待复查报告。抗体待复查报告。初筛实验呈阳性反响样品的转送：初筛实验呈阳性反响样品的转送： 填写填写“HIVHIV抗

11、体待复测送检单，经抗体待复测送检单，经1 1名检验名检验人员和人员和1 1名具有中级以上技术职称的人员审核名具有中级以上技术职称的人员审核签字。送当地艾滋病筛查中心实验室，再转签字。送当地艾滋病筛查中心实验室，再转送艾滋病确认实验室，或在本实验室复检后送艾滋病确认实验室，或在本实验室复检后直接送确认实验室。直接送确认实验室。 对筛查阴性和阳性者，均需做好检测后咨询。对筛查阴性和阳性者，均需做好检测后咨询。 初筛实验结果的报告 n对HIV抗体筛查实验：n“ “HIV抗体阴性报告可用附表n“+ 不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查报告对HIV抗体筛查实验，呈阴性反响者可出具“HIV抗体阴性报告

12、对初筛实验呈阳性反响者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查报告 HIV抗体检测确认实验 HIV抗体确认实验抗体确认实验确认实验的试剂：确认实验的试剂： 必需是经国家食品药品监视管理局注必需是经国家食品药品监视管理局注册同意、在有效期内的试剂。册同意、在有效期内的试剂。确认实验方法：确认实验方法： 包括免疫印迹实验包括免疫印迹实验(WB)、条带免疫实、条带免疫实验验(LIATEK HIV)、放射免疫沉淀实、放射免疫沉淀实验验(RIPA)及免疫荧光实验及免疫荧光实验(IFA)。国内。国内常用确实认实验方法是常用确实认实验方法是WB。蛋白印迹实验蛋白印迹实验WBWB广泛运用确实认实验广泛运用确实

13、认实验根本原理根本原理HIVHIV全病毒抗原经过聚丙烯酰胺凝胶电泳全病毒抗原经过聚丙烯酰胺凝胶电泳, ,将分子量大小不等的将分子量大小不等的HIVHIV抗原蛋白带别抗原蛋白带别分开来分开来, ,然后再把这些曾经分别的不同然后再把这些曾经分别的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状膜切割成条状, ,每一条硝酸纤维素膜上每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分别过的均含有经电泳分别过的HIVHIV病毒抗原。病毒抗原。n将待检血清样品加到硝酸纤维素膜上将待检血清样品加到硝酸纤维素膜上, ,恒恒温震荡温震荡, ,使其充分接触反响使其充分接触反响, ,血清中假设血

14、清中假设含有抗含有抗HIVHIV抗体抗体, ,就会与膜条上的抗原带就会与膜条上的抗原带相结合。相结合。n参与酶偶联的抗人参与酶偶联的抗人IgGIgG抗体和底物，即可抗体和底物，即可使有反响的抗原使有反响的抗原- -抗体结合带呈现紫褐色抗体结合带呈现紫褐色, ,根据出现条带情况断定结果。根据出现条带情况断定结果。蛋白质抗原分子经电泳分开血液中的抗体与抗原反响，构成不同的条带Western Blot方法加血浆加血浆洗洗加酶结合物加酶结合物(Ab-HRP) 洗洗加底物加底物其可检测标本中针对其可检测标本中针对HIVHIV不同抗原的抗体，不同抗原的抗体，故被用做确认试剂。故被用做确认试剂。不同的研讨机

15、构有不同的断定规范不同的研讨机构有不同的断定规范无无HIV-1HIV-1特异性条带特异性条带ENV ENV 或或ENV+p24ENV+p24CHINA无条带无条带1 ENV + p24/p31FDAUSA无条带或只需无条带或只需P17P172 ENV+GAG+POLWHO阴阴 性性阳阳 性性组组 织织“不确定不确定()：出现：出现HIV-1特异性条带，但带型缺特异性条带，但带型缺乏以乏以 确认阳性，每三个月随访一次，共两确认阳性，每三个月随访一次，共两次，次， 仍属可疑，判为阴性仍属可疑，判为阴性a 强阳性对照强阳性对照HIV-1和和HIV-2b弱阳性对照弱阳性对照HIV-1c阴性对照阴性对照

16、d典型的典型的HIV-2血清阳性反响血清阳性反响不确定标本的处置n缘由特异性和非特异性n要素标本种类，操作技术，感染时 n 间，指征把握等n处置随访留意一根条带n保管实验中应留意的问题严厉按照阐明书操作和阅读判别结果典型带型和颜色；强调env带非典型全而淡、一根主要条带、高危人群、不确定，等等特异性高，但也有漏检核对、多种、操作技术免疫印迹法免疫印迹法WB，HIV-1/2混合型混合型HIV-1阳性反响阳性反响不确定反响不确定反响 出现出现HIV-2指示条带指示条带报告报告HIV-1阳性阳性不确定反响不确定反响阳性反响阳性反响阴性反响阴性反响报告阴性报告阴性每每3个月随访个月随访1次，共次，共2

17、次，仍属可疑，那么报告阴性；如随访期间次，仍属可疑，那么报告阴性；如随访期间HIV抗体出现阳抗体出现阳性反响那么报告阳性。随访期间可根据需求，检测病毒核酸和或性反响那么报告阳性。随访期间可根据需求，检测病毒核酸和或P24抗原，作为辅抗原，作为辅助诊断。助诊断。阴性反响阴性反响报告阴性报告阴性筛查实验阳性反响样品筛查实验阳性反响样品报告报告HIV-2血清学阳性血清学阳性免疫印迹法免疫印迹法WB，HIV-2图2 HIV抗体确认检测流程P24抗原检测窗口期4th gen 3rd gen= =1st-2nd genHIV antigenIgM abIgG abDetection limit= wind

18、ow第一第一/二代试剂检测二代试剂检测IgG抗体，第三代试剂检测抗体，第三代试剂检测IgG 、IgM抗体抗体,第四代试剂同时检测第四代试剂同时检测IgG、 IgM抗体和抗体和P24抗原使窗口期缩短。抗原使窗口期缩短。窗口期n窗口期的决议要素n初筛试剂质量和测试技术n机体免疫反响n病毒特性n窗口期无法防止 P24抗原测定抗原测定适用范围适用范围检测原理检测原理nP24抗原的检测通常是采用ELISA夹心法，知抗体包被固相反响板孔底，参与待测血清，假设血清中含有P24抗原那么与包被抗体构成抗原-抗体复合物，再参与酶HRP标志的HIV-1抗体与抗原结合，加底物显色，在酶标仪上读结果。n为了提高检测血清中P24抗原的敏感性，需先将血清中免疫复合物解离后再进展测定n目前已开展了ICD P24抗原immun-complex disassociate，免疫复合物解离，ICD测定试剂，用于HIV-1 P24抗原测定。即使将复合物解离，敏感性提高，也只能在大约50%无病症感染者中检出P24抗原。 结果报告和解释结果报告和解释定性分析：定性分析：1、 HIV-1 P24抗原的阳性结果必需经过中和实验确认。抗原的阳性结果必