人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达精

1、人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达（1）目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N端193个氨基酸的重组表达质粒，诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RTPCR勺方法从HL60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列，克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET28a中，构建重组的原核表达质粒PETBPI193转化大肠杆菌BL21菌株，用IPTG诱导表达蛋白。应用SDSPAGE测蛋白表达倩况，计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比；Westernblot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段，构

2、建了TBPI193亚克隆和PETBPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导，经SDSPAGE测表明，成功表达了6HisBPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%Westernblot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PETBPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内，诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。关键词：杀菌/渗透增强性蛋白；基因表达；大肠杆菌Expressionofhumanbactericidal/permeabilityincreasingproteinNterminalfragmentinE.coliABSTR

3、ACT:ObjectiveToconstructaprokaryoticexpressionplasmidofcDNAsequenceencodingfirst193aminoacidsofBPINterminalandtoexpressitinE.coliBL21.MethodsTotalRNAwasextractedfromHL60cellandthenwasamplifiedbyusingRTPCR.ThePCRproductwasclonedintopMD18Tvector.BPI193genewasdirectlyclonedintoPET28aplasmidontheroleofT

4、4DNAligase.PETBPI193recombinantexpressionvectorwastransformedintocompetentE.coliBL21andproteinexpressionwasinducedbyIPTG.FusionproteinwasdetectedbySDSPAGEandWesternblot.ResultsA579bpDNAampliconwasamplifiedbyRTPCR.TBPI193subcloneandPETBPI193recombinantexpressionplasmidwasconstructedsuccessfully.6HisB

5、PI193fusionproteincontaining193aminoacidsofBPINterminalwasexpressedbyIPTGinducedmethod.FusionproteinwasdetectedbySDSPAGEandconfirmedbyWesternblot.Theexpressedfusionproteinconstituted12%oftotalbacterialprotein.ConclusionPETBPI193recombinantexpressionplasmidwasconstructedsuccessfully.TotransformPETBPI

6、193recombinantplasmidintoE.coliBL21and6HisBPI193fusionproteinwasexpressedbyIPTGinducedmanner.KEYWORDS:bactericidal/permeabilityincreasingprotein;geneexpression;E.coli迄今为止，对脂多糖引起的并发症，如内毒素血症与败血症休克仍没有有效的治疗手段，临床治疗急需新的抗革兰阴性(G-)菌感染的药物。人杀菌渗透增强性蛋白(bactericidal/permeabilityincreasingprotein,BPI)是对细菌高度稳定的非催化蛋

7、白，主存在于人及哺乳动物多形核白细胞(PMN珀嗜天青颗粒中，也可微量表达于PMNffi单核细胞表面13。最新研究表明，BPI还可表达于嗜酸性粒细胞和上皮细胞45,它不仅具有特异性杀伤G-菌的作用，还可以中和内毒素，是一种具有广阔应用前景的“新型抗生素”6。在本实验中，我们建立了稳定表达BPI氨基端(BPI193)的原核表达系统，获得了高产量的纯化蛋白，为进一步研究BPI在体内外的生物活性，研发新的BPI产品创造条件。1材料与方法1.1 细胞株、菌种和质粒HL60细胞株由第四军医大学微生物教研室雷迎峰博士惠赠；E.coliDH5a和E.coliBL21为本室保存菌株；pMD18T载体为Takar

8、a公司产品；PET28a®核表达质粒为Novagen公司产品。1.2 主试剂Trizol为Invitrogen公司产品；cDN顺一链合成逆转录试剂盒购自Fermentas公司；Xhol、BamH限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶均为Takara公司产品；DEPSigma公司产品；DNTPs勾自北京鼎国生物公司；小剂量质粒提取试剂盒和DL2000DNAmarker购自北京天为时代公司，小分子量蛋白marker购自华美公司；溃疡性结肠炎患者血清由西安交通大学医学院第二附属医院检验科李步荣医师惠赠；山羊抗人HRPIgG购自博士德生物公司；1640培养基购自Gibco公司；D

9、NAS胶回收试剂盒为北京赛百盛公司产品。1.3 引物的设计与合成根据GenBank数据库已收录的BPIcDNA的基因序列，借助于软件PrimerPremier5.0和DNAclub设计了扩增BPI1193个氨基酸的上下游扩增引物。P15'CTGGATCCATGGTCAACCCTGGCGTBGmHI)P25'CCGCTCGAGTTACAGAGTCTGGAAATA(AGGI3在引物的5'端分别添加了BamH和Xhol两个酶切位点，以确保酶切后可以插入PET28a®核表达载体中，并且读码框正确，还添加了起始密码ATGffi终止子TAA扩增的BPI位于124-702b

10、p,DNAfe度为579bp。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。1.4 方法1.4.1 RTPCR扩增目的基因用Trizol试剂从HL60细胞中提取总RNA按试剂盒说明反转录出cDNA1一链，然后进行PCRT增目的基因。经15g/L的琼脂糖凝胶电泳分析结果后，用凝胶回收试剂盒回收PCRT物。通过10g/L的琼脂糖凝胶电泳观察回收情况并目测定量。1.4.2 PCR产物与T载体的连接及鉴定按照pMD18戢体说明书，进行PCR0收产物和pMD18戢体的连接反应。将连接产物转化感受态E.coliDH&,经抗生素和蓝白斑筛选出阳性菌落，然后用PCR限制性内切酶分析和DNAW序证实BPI

11、193是否插入T载体以及基因序列有无突变。1.4.3 PETBPI193重组质粒的构建分别用BamH和Xhol双酶切TBPI193和原核表达载体PET28a酶切产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳后，用北京赛百盛公司凝胶回收试剂盒回收，DNAt量后在T4DNAI接酶削用下将BPI193定向克隆入原核表达载体PET28a中，构建重组的原核表达质粒PETBPI193转化大肠杆菌BL21菌株，筛选出阳性菌落，并采用PCRffi限制性酶切技术鉴定，得到表达菌。1.4.4 目的蛋白的诱导表达和鉴定用IPTG诱导表达菌，采用不同的IPTG诱导浓度（1、2、3、4mmol/L）和诱导时间（1、2、3、4、5、6h

12、）,应用SDSPAGE技术检测细菌蛋白表达情况，获得最佳表达条件，计算机薄层扫描分析表达目的蛋白占菌体总蛋白百分比。应用WesternBlot技术检测表达蛋白的特异性。作者：董伟，董晓慧，楚雍烈，杨娥，胡刚，郑建武【关键词】基因表达摘目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白（BPI）N本篇论文是由3COMR档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。2结果2.1 RTPCR扩增结果RTPCR5应后取5L经15g/L琼脂糖凝胶电泳检测，结果扩增出约602bp的基因片段，与预期大小相符。2

13、.2 BPI193基因片段与T载体的连接将获得的BPI193基因片段RTPCR勺产物凝胶回收后，按照pMD18瞰体说明书操作，双酶切结果切出约585bp和2690bp左右的基因片段，与预期相符（图1）。送上海华诺公司测序，证明BPI193基因序列完全正确，命名为TBPI19&图1重组质粒TBPI193的PCR双酶切鉴定（略）Fig.1IdentificationofplasmidTBPI193byPCRandrestrictionenzymedigestion1:DL2000DNAmarker;2:BPI193fromPCR;3:restrictionenzymedigestionwi

14、thBamHIandXhoI2.3PETBPI193重组质粒的构建用BamH和Xhol分另双酶切TBPI193和PET28破粒，凝胶回收试剂盒回收得到纯化产物。用T4连接酶连接，转化E.coliDH5a,卡那霉素筛选细菌，并进行PCRf口BamH+XhoI双酶切鉴定，PCFT增出约602bp的基因片段，双酶切获得约585bp和5329bp的基因片段，与预期相符（图2）。图2PETBPI193重组质粒的PCR酶切鉴定（略）Fig.2IdentificationofrecombinantplasmidPETBPI193byPCRandrestrictionenzymedigestion1:DL20

15、00DNAmarker;2:PCRproductofTBPI193;3:PCRproductofPETBPI193;4:doublerestrictionenzymedigestionwithBamHIandXho2.4BPI193重组蛋白的表达和鉴定用IPTG诱导表达菌BL21,发现随时间延长蛋白量有所增加，在4h时表达量较大。在不同IPTG浓度的条件下诱导蛋白表达，2-3mmol/L时蛋白表达量比较丰富。诱导后在21ku左右处有蛋白表达，该蛋白大小与预期相符。经薄层扫描分析，表达蛋白量占菌体总量的12%左右。可溶性分析表明表达的BPI193重组蛋白以包涵体的形式释放（图3）。Western

16、blot鉴定，结果表明用IPTG诱导后的PETBPI193s达菌在相应约21ku位置出现特异性染色带，而未诱导的表达菌没有该条带（图4）,说明表达的目的蛋白具有特异性。图3重组蛋白BPI193在IPTG诱导浓度不同时的表达情况（略）Fig.3 ExpressionofrecombinantproteinBPI193atdifferentinducerconcentrations1: lowerMWproteinmarker;2:noninducedPETBPI193;3-6:IPTGinducedPETBPI193at1,2,3,4mmol/L图4重组蛋白BPI193的Westernblot鉴

17、定（略）Fig.4 IdentificationofrecombinantproteinBPI193byWesternblot1:noninducedPETBPI193;2:inducedPETBPI1933讨论根据BPI氨基端的基因序列设计了1对特异性引物，采用RTPCR勺方法从HL60细胞中成功扩增了602bp的基因片段，与预期的目的基因片段大小相符。将BPI193基因片段克隆入pMD18瞰体，构建TBPI193重组质粒。转化E.coliDH&,通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，经PCRffi限制性内切酶鉴定分析（BamHI和Xhol双酶切），均获得了与预期相符的实验结果。经DNAM序分

18、析，本实验获得的BPI193基因序列与文献报道完全一致，没有突变。PET28a为原核表达载体。将BPI193基因片段定向克隆入PET28ag核表达载体中，转化大肠杆菌DH&,初步筛选出阳性克隆后，通过菌落PCFO及BamH和Xhol双酶切分析进一步鉴定，与预期结果相一致。最后再进行DNA测序分析，确证BPI193基因片段准确无误的正向插入到表达载体中，并且BPI193的N末端与6个组氨酸相连接。PETBPI193重组表达质粒构建成功。PETBPI1938组表达质粒转化表达菌E.coliBL21,经过IPTG诱导，获得了以包涵体形式表达的预期重组蛋白，其分子质量为21ku左右，并且可以与

19、BPI抗体特异性结合，充分证明BPI193表达成功。传统制备BPI多采用柱层析的方法，国外获得BPIN端功能性片段多采用真核系统表达611，但这些方法生产条件求比较高，消耗巨大，影响了临床应用。研究表明BPI糖基化部位与蛋白的活性没有显著关系，BPI是否糖基化对于抗体与抗原的识别来说没有明显影响12o本研究采用原核表达系统表达BPI193重组蛋白，大大降低了生产成本，为后续的实验研究奠定了基础。本研究选用PET28a乍为原核表达载体，它含有T7启动子，是一种T7噬菌体表达系统，具有能转录大肠杆菌RN咪合酶不能有效转录基因的优点。其多克隆位点上游有6个组氨酸和凝血酶位点，可利用固化Ni2亲和层析

20、柱纯化表达的融合蛋白，还可以用凝血酶切割纯化的融合蛋白，从而获得重组的目的蛋白。是一种较好的表达载体。为了获得最优化的蛋白表达条件，在IPTG终浓度为1mmol/L时延长表达时间，发现随时间延长蛋白量有所增加，但增长幅度不大，在4h时表达量较大。在不同IPTG浓度的条件下诱导蛋白表达，发现2-3mmol/L时蛋白表达量比较丰富。生长温度可能是影响大肠杆菌高水平表达的主因素之一，通过试验确定最佳温度是表达外源蛋白的关键。本实验分别在加入IPTG后于37、35、33c进行BPI193重组蛋白的诱导表达，虽然几种温度条件下融合蛋白都可以表达，但温度较低时蛋白表达量更加丰富，表达也比较稳定。BPI19

21、3基因片段被定向克隆于PET28ag核表达载体后，其N端与6个组氨酸形成融合蛋白，并在IPTG的诱导下得以表达。经蛋白的可溶性分析显示，BPI193与组氨酸融合蛋白在细菌中主以包涵体的形式进行表达，而在细菌裂解液上清中没有检测到BPI193融合蛋白。虽然反复优化诱导表达条件，但BPI193重组蛋白总是以包涵体的形式存在。文献中也提示，几种利用原核表达系统表达人BPI时，目的蛋白也总是以包涵体的形式释放。我们推测可能与以下因素有关：大肠杆菌BL21进入对数生长期时间短，生长速度快，由于细菌生长过度或者生长过速加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体；BPI193是BPIN末端前193个氨基酸，包含

22、了3个与生物活性密切相关的区域，具有完整BPI特异性杀伤GNB结合及中和LPS的能力。大肠杆菌本身就是革兰阴性菌，因此对于E.coliBL21来说，BPI193重组蛋白具有细胞毒性，可能会对细菌产生杀伤作用。所以细菌在合成过程中将蛋白纳入包涵体中，消除或减弱蛋白的生物活性，减轻对宿主菌的毒性作用。BPI193重组蛋白以包涵体的形式存在有助于表达产物的分离和提取，也可以减少胞内蛋白酶对蛋白的破坏和降解。因此，在本实验中具有有利的方面。但是，获得具有功能性的重组蛋白还需进行复性处理，回复蛋白的空间结构和生物活性，这会给生产使用带来一些麻烦，有待进一步完善。作者：董伟，董晓慧，楚雍烈，杨娥，胡刚，郑

23、建武【关键词】基因表达摘目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N本篇论文是由3COMR档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。虽然经过多种方法优化蛋白表达条件(包括延长诱导时间，增加诱导剂浓度，降低诱导时细菌培养温度)，但是BPI193融合蛋白的表达量仍然很低，经分析只占菌体总蛋白的12%fc右。这可能是因为：诱导条件没有达到最优，诱导前后细菌培养的条件不合适；Bluow等13研究发现，完整的BPI以及含有BPIC端和LBPN端的嵌合体都可以稳定的储存在细胞中，而缺失了

24、C端的BPI在储存过程中会被降解。所以，推测部分BPI193与组氨酸的融合蛋白在表达过程中可能被细菌降解。这尚需在今后的实验中进一步研究。参考文献：1WeersinkAJ,vanKesselKP,vandenTolME,etal.Humangranulocytesexpressa55kDalipopolysaccharidebindingproteinonthecellsurfacethatisidenticaltothebactericidal/permeabilityincreasingproteinJ.JImmunol,1993,150(1):253263.2WeissJ.Leucocy

25、tederivedantimicrobialproteinsJ.CurrOpinHematol,1994,1(1):7884.3CalafatJ,JanssenH,KnolEF,etal.Thebactericidal/permeabilityincreasingprotein(BPI)ismembraneassociatedinazurophilgranulesofhumanneutrophils,andrelocationoccursuponcellularactivationJ.APMIS,2000,108(3):201208.4CalafatJ,JanssenH,ToolA,etal.

26、Thebactericidal/permeabilityincreasingprotein(BPI)ispresentinspecificgranulesofhumaneosinophilsJ.Blood,1998,91(12):47704775.5GeraldineCanny,OferLevy,GlennTF,etal.Lipidmediatorinducedexpressionofbactericidalpermeabilityincreasingprotein(BPI)inhumanmucosalepitheliaJ.ProcNatlAcadSciUSA,2002,99(6):39023

27、907.6WeissJ,ElsbachP,OlssonI,etal.PurificationandcharacterizationofapotentbactericidalandmembraneactiveproteinfromthegranulesofhumanpolymorphonuclearleukocytesJ.JBioChem,1978,253(8):26642672.7OoiCE,WeissJ,ElsbachP,etal.A25kDaNHzterminalfragmentcarriesalltheantibacterialactivitiesofthehumanneutrophi1

28、60kDabactericidal/permeabilityincreasingproteinJ.JBiolChem,1987,262(31):1489114894.8OoiCE,WeissJ,DoerflerME,etal.Endotoxinneutralizingpropertiesofthe25kDNterminalfragmentandanewlyisolated30kDCterminalfragmentofthe5560kDbactericidal/permeabilityincreasingproteinofhumanneutrophilsJ.JExpMed,1991,174(3):649655.9GazzanoSantoroH,ParentJB,GrinnaL,etal.Highaffinitybindingofthebactericidal/permeabilityincreasingproteinandare