DNA的提取与鉴定

1、在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出8、DNA的鉴定 D N A 与 二 苯 胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 甲基绿 （蓝绿色）1、动物细胞动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可答：蒸馏水对于鸡

2、血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？2、植物细胞植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA

3、量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质?答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离讨论：方案二与方案三的原理有什么不同?DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95 ） ，

4、静置23min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导

5、致DNA分子不能形成絮状沉淀。3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。二苯胺试剂的配制称取1.5g二苯胺，溶于100ml冰醋酸中，再加入1.5ml浓硫酸，用棕色瓶保存。临用前，在10ml的上述溶液中再加入0.1ml体积分数为0.2%的乙醛溶液。 1.1.制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）0.1g/mL柠檬酸钠柠檬酸钠100mL活鸡鲜血活鸡鲜血180mL500mL烧杯中，玻棒烧杯中，玻棒搅拌搅拌，离心、分离或静置沉淀。离心、分离或静置沉淀。2.2.提取提取DNA。取血细胞取血细胞5-10mL20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向蒸馏水，用玻棒沿一个

6、方向快速搅拌快速搅拌。纱布纱布过滤过滤：滤液中含：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。和其他核物质，如蛋白质。.提取提取血血细胞核物质：细胞核物质：.溶解核内的溶解核内的DNA：滤液滤液2mol/L的的NaCl溶液溶液40mL，玻棒沿一个方向，玻棒沿一个方向轻缓轻缓搅拌搅拌。三、实验步骤.析出析出含含DNA的粘稠物：的粘稠物：.滤取含滤取含DNA的粘稠物：的粘稠物：. DNA粘稠物的再溶解：粘稠物的再溶解： 在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻搅轻轻搅拌拌，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水（此时

7、（此时NaCl溶液的浓度相当于溶液的浓度相当于0.14mol/L）。）。 用多层纱布用多层纱布过滤过滤，含，含DNA的粘稠物留在纱布上。的粘稠物留在纱布上。 20mL2mol/L的的NaCl溶液溶液步骤含步骤含DNA的粘稠物的粘稠物在20mL烧杯中烧杯中轻缓搅拌轻缓搅拌3min，使尽可能多的，使尽可能多的DNA溶解在溶解在NaCl溶液。溶液。.过滤含有过滤含有DNA的的NaCl溶液：溶液：用放有两层纱布的漏斗用放有两层纱布的漏斗过滤过滤步骤所得的溶液，滤液中步骤所得的溶液，滤液中含有含有DNA。.提取含有杂质较少的提取含有杂质较少的DNA：步骤所得的滤液体积分数为步骤所得的滤液体积分数为95%

8、的冷却酒精的冷却酒精50mL，用玻棒沿一个方向用玻棒沿一个方向轻缓搅拌轻缓搅拌，溶液中（，溶液中（析出析出）出现乳）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。面的水分。3.DNA的鉴定：的鉴定：加入二苯胺试剂加入二苯胺试剂4mL，用玻棒，用玻棒搅拌搅拌使使DNA溶解，沸水溶解，沸水浴浴5min，观察溶液是否出现浅蓝色。，观察溶液是否出现浅蓝色。1.共有共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌三次过滤，两次析出，七次搅拌”2.加入加入“两次蒸馏水，两次蒸馏水，三次三次NaCl溶液，一次酒精，一次酒精”三、实验小结三、实验小结四、实验原理

9、拓展介绍。四、实验原理拓展介绍。1.DNA的释放。的释放。 DNA主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会释主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会释放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可以放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可以大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速搅拌大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速搅拌的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但释释放出来的大量放出来的大量DNA与与RNA、蛋白质结合在一起，即释放、蛋白质结合在一起，即释放的不是纯净的的不是纯净的DNA，常称为，常称为DNA核蛋白核蛋白。2.

10、DNA与蛋白质分离。与蛋白质分离。在高浓度（在高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶解，）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶解，析出析出DNA并溶解在高浓度的氯化钠溶液中并溶解在高浓度的氯化钠溶液中3.DNA的析出与获取。的析出与获取。因为因为DNA在低浓度（在低浓度（ 0.14mol/L ）的氯化钠溶液中溶解）的氯化钠溶液中溶解度小，而蛋白质的在其中的溶解度大度小，而蛋白质的在其中的溶解度大。所以在向含。所以在向含DNA的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶液，从而使液，从而使DNA溶解度下降，蛋白质溶解度增高。溶解度下降，蛋白质溶

11、解度增高。4.DNA的再溶解。的再溶解。用高浓度（用高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液再溶解）的氯化钠溶液再溶解DNA粘稠物。粘稠物。5.DNA的沉淀和浓缩。的沉淀和浓缩。 对于除去了蛋白质的对于除去了蛋白质的DNADNA的氯化钠溶液，必须再进的氯化钠溶液，必须再进一步沉淀和浓缩，常用一步沉淀和浓缩，常用酒精沉淀法酒精沉淀法。即往。即往含有含有NaNa的的DNADNA溶液，加入体积分数为溶液，加入体积分数为95%95%的冷却酒精，混匀后可的冷却酒精，混匀后可以使以使DNADNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNADNA丝状物丝状物，悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合

12、液再放入冰悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放入冰箱中冷却几分钟即可。浓缩后的箱中冷却几分钟即可。浓缩后的DNADNA丝状物可以用玻棒丝状物可以用玻棒（玻棒有吸附（玻棒有吸附DNADNA的作用）缓缓旋转的方法卷起。的作用）缓缓旋转的方法卷起。6.DNA的鉴定。的鉴定。100DNA二苯胺二苯胺 蓝色物蓝色物鉴定时蓝色的深浅与溶液中鉴定时蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关。的含量多少有关。方法步骤方法步骤 加入物质加入物质 目的目的 1.制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液 2.提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1蒸馏水 3.溶解细胞核内的DNA 2 m1L 的NaCI溶液40mL 幻灯片 17

13、4.析出含DNA的黏稠物 蒸馏水 5.滤取含DNA的黏稠物 6.将DNA的黏稠物再溶解 2 molL 的NaCl溶液20 mL 7.过滤含DNA的NaCl 溶液 8.提取含有杂质较少的 DNA 冷却的95的酒精50 mL A:(1)向试管中加入0.015 molL 的NaCl溶液5mL (2)加入DNA (3)4 mL二苯胺试剂 9.DNA的鉴定 B:(1)向试管中加入0.015molL 的NaCl溶液5mL (2)4 mL 二苯胺试剂 加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固加速血细胞破裂加速血细胞破裂 溶解溶解DNA 使使2mol/L的的NaCl溶液稀释至溶液稀

14、释至0.14mol/L使得使得DNA最大限度地释出最大限度地释出 使含使含DNA的黏稠物被留在纱布上的黏稠物被留在纱布上使含使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中除去含除去含DNA的滤液中的杂质的滤液中的杂质提取提取DNA A出现蓝色出现蓝色 B无变化无变化本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DNA时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）或吐温等化学试剂。2.实验中实验中NaCl的物质的量浓度为的物质的量浓度为2 molL和和0.14 molL对对DNA有何影响有何影响?1.在在DNA的

15、粗提取实验过程中，两次向烧杯的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是中加入蒸馏水的作用是( )。A.稀释血液、冲洗样品稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低使血细胞破裂、降低NaCl浓度使浓度使DNA析出析出C.使血细胞破裂、增大使血细胞破裂、增大DNA溶解量溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA答：答：B答：答：前者是溶解前者是溶解DNA，后者是使，后者是使DNA析出析出3.DNA3.DNA遇二苯胺遇二苯胺( (沸水浴沸水浴) )会染成会染成( ) ( ) A. A.砖红色砖红色 B.B.橘黄色橘黄色 C.C.紫色紫色 D.D.蓝色蓝色4.

16、提取鸡血中的提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液时，为什么要除去血液中的上清液中的上清液?答：答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以，所以要除去上清液要除去上清液(含有蛋白质含有蛋白质)。答：答：D5.5.关于关于DNADNA粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因是什么？请回答下列的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因是什么？请回答下列问题：问题：（1 1）鸡血细胞中红细胞含有细胞核，家鸡属于鸟类，新陈代）鸡血细胞中红细胞含有细胞核，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中谢旺盛，因而血液中 细胞数目较多，可以提供丰富细胞数目较多，可以提供丰富的的 。（2 2）实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不）实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不用鸡全血，主要原因是用鸡全血，主要原因是 。（3 3）生活在牧区的人们，采集