基因工程--工具酶ppt课件

1、工具酶工具酶 第四章第四章 工具酶工具酶 工具酶工具酶基因工程技术中能用于基因工程技术中能用于DNA和和RNA 的合成、衔接的合成、衔接、切割和修饰的各种酶。、切割和修饰的各种酶。包括：包括：限制酶限制酶,核酸酶核酸酶.聚合酶聚合酶, 连接酶连接酶, 激酶激酶, 磷酸酶磷酸酶, 第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶（Restriction Endonuclease）一一. 细菌的限制一修饰现象被发现细菌的限制一修饰现象被发现瑞士塞尔生物研究中心瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论：提出限制一修饰理论： 核酸内切酶降解细菌外源核酸内切酶降解细菌外源DNA, 修饰酶保护自身修饰酶保护

2、自身DNAArber首次从首次从 E.Coli B菌株中分离出菌株中分离出型限制酶型限制酶EcoB美美Hopkings大学大学 H.Smith 从流感嗜血菌中分离从流感嗜血菌中分离 型型 限制酶限制酶 Arber, Smith获得获得1978 年年Nobel奖奖二二.限制酶系统分类和命名限制酶系统分类和命名 1985年后大量限制酶被发现，已从年后大量限制酶被发现，已从350多种微生多种微生物中发现物中发现2000多种限制酶，识别多种限制酶，识别108种不同的特定种不同的特定序列序列限制性内切酶的分类限制性内切酶的分类 型型: 特异识别、随机切割特异识别、随机切割 型：特异识别、同点切割型：特异

3、识别、同点切割 型：特异识别、异地切割型：特异识别、异地切割通常所指的限制酶即通常所指的限制酶即类酶类酶 限制酶特性比较限制酶特性比较 I型型 II型型 III型型限制与修饰由限制与修饰由同一酶承担同一酶承担 是是 否否 是是酶反应辅助因子酶反应辅助因子ATP.mg+ SAM mg+ ATP.mg+SAM识别位点特性识别位点特性 / 4-6bp回文对称回文对称/切割位点切割位点 间隔间隔1kb 识别点中识别点中 距距3端端24-26bp举例举例 EcoB BamHI EcoPL识别位点识别位点 TGAN8TGCT G GATTC AGACC克隆工作中用途克隆工作中用途 无无 有有 无无SAM:

4、 硫一腺苷甲硫氨酸硫一腺苷甲硫氨酸三三. .系统命名法系统命名法 限制性内切酶的命名方限制性内切酶的命名方法法 属名属名 种种 变种变种 序数序数 1 1字母字母 2 2字母字母 1 1字母字母 (EcoRI) E co (EcoRI) E co R IR I (HindIII)H in (HindIII)H in d IIId III (BamHI) B am (BamHI) B am H IH I 四四.一般限制酶的识别特点一般限制酶的识别特点1. 大多数是严格的识别顺序，少数大多数是严格的识别顺序，少数可变可变2. 识别顺序的碱基数一般为识别顺序的碱基数一般为4-6 bp，少数识别更长少

5、数识别更长3. 多数识别位点具有旋转对称性，多数识别位点具有旋转对称性，少数的识别位少数的识别位 点在切割位点之外，具旋转对称点在切割位点之外，具旋转对称性性 4bp HpaC CGG Hae GG CC 5bp Ava G GWCC EcoR CCWGG 6bp BamH G GATTC SmaCCC GGG11bp Bg1 GCCNNNN NGGC 12bp BstXCCANNNNN NTGC N=A, T, G, C五五. 限制酶的切割末端限制酶的切割末端 5粘端粘端（EcoR I） 3粘端粘端 （Pst I） 平端平端 （Sma I）六六.限制酶产生的末端的连接限制酶产生的末端的连接

6、1. 匹配粘端匹配粘端: 直接连接直接连接 2. 平末端平末端: 万能连接万能连接 3. 不匹配粘端：不匹配粘端： S1 Nuclease切去突切去突出端出端 或或Klenow补平补平七七.识别位点与切割方式之间的关系识别位点与切割方式之间的关系 1.识别不同，切割不同识别不同，切割不同 eg: BamHI EcoRI -G GATC C- - A GATCT- -C CTAG G- - T CTAG A- 2.识别不同，切割产生末端相同识别不同，切割产生末端相同(同尾酶同尾酶) eg: BamHI Bg1 - A GATCT -G GATCC - T CTAG A -CCTAG G3.识别相

7、同，切割不同识别相同，切割不同 eg: SmaI XmaI -CCC GGG-C CCGG -GGG CCC- -G GGCC C-4识别相同，切割相同识别相同，切割相同同工酶同工酶 同裂酶同裂酶 eg: Hpa Msp -CCGG- -C * C GG- -GG CC- -G G CC-八八.限制酶反应的影响因素限制酶反应的影响因素1. 温度：一般温度：一般37C，有例外，有例外,如：如：SmaI 25C， BclI 50C，TaqI 65C2. 缓冲液：高、中、低盐之分缓冲液：高、中、低盐之分 (NaCl)3. 时间：时间：1-1.5小时小时4. 反应体积和甘油浓度：酶反应体积和甘油浓度：

8、酶8.0) 存在有害试剂存在有害试剂(1%乙乙 醇醇, DMSO, 乙乙二醇二醇) 阳离子变化阳离子变化:Mn+, Co+, Zn+, Cu+代替代替mg+酶的灭活酶的灭活 第二节 修饰酶一.分类细菌DNA聚合酶 *E. Coli DNA聚合酶全酶） *Klenow酶T4噬菌体DNA聚合酶 T4噬菌体DNA聚合酶 *测序酶修饰的T7 pol） *Taq DNA聚合酶 *反转录酶 末端脱氧核苷酸转移酶依赖于DNA的RNA聚合酶 SP6噬菌体RNA聚合酶 T3噬菌体RNA聚合酶 T4噬菌体RNA聚合酶连接酶连接酶 E. Coli DNA连接连接 *T4 DNA连接酶连接酶 T4噬菌体噬菌体 RNA

9、连接酶连接酶激酶激酶 T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶磷酸酶磷酸酶*碱性磷酸酶碱性磷酸酶核酸酶核酸酶 Ba131核酸酶核酸酶 S1核酸酶核酸酶 绿豆核酸酶绿豆核酸酶 RNaseA RNaseT1 DNaseI EXo 噬菌体外切核酸酶噬菌体外切核酸酶二.聚合酶1. E. Coli DNA聚合酶 活性:（153DNA聚合酶活性 （235核酸外切酶活性 （353核酸外切酶活性 主要用途：切口平移法标记DNA2. Klenow酶酶 枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解 E. Coli DNA聚合酶得到的该酶的大片段聚合酶得到的该酶的大片段 活性：（活性：（153聚合酶活性

10、聚合酶活性 （235外切核酸酶活性外切核酸酶活性 主要用途：主要用途： (1)补平补平3凹端凹端 (2)补平补平3凹端，末端标记凹端，末端标记 (3)合成合成cDNA第二链第二链 (4)体外诱变中从模板合成体外诱变中从模板合成DNA第二链第二链3. T4 噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶 活性：（活性：（153聚合酶活性聚合酶活性 （235外切核酸酶活性外切核酸酶活性, 比比 Klenow 酶强酶强200倍倍 用途用途: 3突出端切平突出端切平 4. T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶 活性：活性： 53聚合酶活性很强聚合酶活性很强, 无无35外切核酸酶活性外切核酸酶活性 主要用途：修饰后用于测

11、序主要用途：修饰后用于测序5. Taq酶酶 耐热耐热(75-80 C)的的DNA聚合酶专用于聚合酶专用于PCR6.逆转录酶：逆转录酶： AWV (源于鸟成髓细胞白血病病毒源于鸟成髓细胞白血病病毒)， Mo-MLV(源于源于Moloney鼠白血病病毒鼠白血病病毒) 活性：活性： (1)53聚合酶活性聚合酶活性 (2) RNaseH活性活性(Mo-MLV 小小,cDNA得率高得率高) 主要用途：主要用途： (1)反转录反转录cDNA (2) 标记标记5突出端补平）突出端补平） (3) 测序测序7.末端转移酶末端转移酶作用作用:在在DNA或或RNA3羟基上加羟基上加dNTP主要用途：主要用途：(1)

12、载体或载体或cDNA加同聚尾加同聚尾(100nt) (2)DNA的的3OH同位素标记同位素标记三三. 激酶激酶T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化催化ATP的的 -磷酸基到磷酸基到DNA或或RNA的的5 OH主要用途主要用途: DNA的的5OH同位素标记同位素标记 (寡核苷酸寡核苷酸)四四. .连接酶连接酶 T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶 衔接：粘端，平端，衔接：粘端，平端，dsDNAdsDNA中的切口，中的切口， 杂交体连接杂交体连接五五. .碱性磷酸酶碱性磷酸酶 包括细菌碱性磷酸酶包括细菌碱性磷酸酶(BAP)(BAP)和小肠碱性磷和小肠碱性磷酸酶酸酶(CIP), (CIP), 虾碱性磷酸酶虾碱性磷酸酶(SAP)(SAP)用途用途: : 去除去除DNADNA、RNARNA、NTPNTP、dNTPdNTP的的5 5磷磷酸根酸根六六. .核酸酶核酸酶1.DNA1.DNA酶酶 为为DNADNA内切核酸酶内切核酸酶, ,水解单链或双链水解单链或双链 用途用途:(1):(1)缺口平移标记探针时产生随缺口平移标记探针时产生随机切口机切口 (2)(2)降解降解DNADNA2.RNA2.RNA酶酶 内切核糖核酸酶内切核糖核酸酶, ,专用降解专用降解RNARNA3. S1核酸酶核酸酶 作用作用:降解