食品理化检验 氨基酸及蛋白质

1、 第三章第三章 食品的营养成分分析食品的营养成分分析水分的测定水分的测定u 蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定u 脂肪的测定脂肪的测定u 碳水化合物的测定碳水化合物的测定u 维生素的测定维生素的测定u 灰分及有关元素的测定灰分及有关元素的测定第三节第三节 食品中蛋白质和氨基酸的测定食品中蛋白质和氨基酸的测定Determination of protein and amino acid in Food复习一下复习一下1.1.蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成 C C：50-55% H50-55% H：6-8% O6-8% O：20-23% 20-23% N N：15-18% S15-18%

2、S：0-4%0-4% 微量元素：还含有微量的微量元素：还含有微量的 P P、CuCu、FeFe、I I 等等2.2.基本结构单位：基本结构单位：氨基酸氨基酸3.3.蛋白质的变性作用。蛋白质的变性作用。（一）蛋白质的生理功能及在食品中的作用（一）蛋白质的生理功能及在食品中的作用（二）食品中的蛋白质含量（二）食品中的蛋白质含量（三）蛋白质系数（三）蛋白质系数（四）蛋白质水解（四）蛋白质水解（五）蛋白质测定方法（五）蛋白质测定方法一、概述一、概述 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分；重要成分； 维持人体的酸碱平衡、水平衡；维持人体的酸

3、碱平衡、水平衡； 物质的代谢及运转都与蛋白质有关物质的代谢及运转都与蛋白质有关; ; 蛋白质是食品的最重要的营养指标。其含量与分解产蛋白质是食品的最重要的营养指标。其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。物直接影响食品的色、香、味。（一）蛋白质的生理功用及在食品中的作用（一）蛋白质的生理功用及在食品中的作用不同食品蛋白质的含量不同，可作为质量检验的一种重要手段。不同食品蛋白质的含量不同，可作为质量检验的一种重要手段。( (二二) ) 食品中的蛋白质含量食品中的蛋白质含量谷类和面食：谷类和面食： （% %）大米（糙米、长粒、生）大米（糙米、长粒、生） 7.97.9大米（白米、长粒、生）大米（白

4、米、长粒、生） 7.17.1小麦粉（整粒）小麦粉（整粒） 13.713.7玉米粉（整粒、黄色）玉米粉（整粒、黄色） 6.96.9玉米淀粉玉米淀粉 0.30.3豆类：豆类：大豆（成熟的种子、生）大豆（成熟的种子、生） 36.536.5豆（腰子状、所有品种）豆（腰子状、所有品种） 23.623.6豆腐（生、普通）豆腐（生、普通） 8.18.1水果和蔬菜：水果和蔬菜：苹果（生、带皮）苹果（生、带皮） 0.20.2芦笋（生）芦笋（生） 2.32.3草莓（生）草莓（生） 0.60.6莴苣（冰、生）莴苣（冰、生） 1.01.0肉、家禽、鱼：肉、家禽、鱼：牛肉（颈肉、烤前腿）牛肉（颈肉、烤前腿） 18.51

5、8.5牛肉（腌制、干牛肉）牛肉（腌制、干牛肉） 29.129.1鸡（可供煎炸的鸡胸肉、生）鸡（可供煎炸的鸡胸肉、生） 23.123.1火腿（切片、普通的）火腿（切片、普通的） 17.617.6鸡蛋（生、全蛋）鸡蛋（生、全蛋） 12.512.5鱼（太平洋鳕鱼、生）鱼（太平洋鳕鱼、生） 17.917.9鱼（罐装金枪鱼滴干的固体）鱼（罐装金枪鱼滴干的固体） 26.526.5乳制品：乳制品：牛乳（全脂、液体）牛乳（全脂、液体） 3.33.3牛乳（脱脂、干）牛乳（脱脂、干） 36.236.2干酪干酪 24.924.9酸奶（普通的、低脂）酸奶（普通的、低脂） 5.35.3不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式

6、不同，故各种不同不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同的蛋白质其含氮量也不同；一般蛋白质含氮量为一般蛋白质含氮量为16%，即一，即一 份氮素相当于份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数）称为蛋白质系数。 不同种类食品的蛋白质系数有所不同不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为青豆，鸡蛋等为6.25，花生为，花生为5.46，大米为，大米为5.95，大豆及其制，大豆及其制品为品为5.71，小麦粉为，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为，牛乳及其制品为6.38。（三）蛋白质系数（三）蛋白质系数

7、 （四）（四） 蛋白质水解蛋白质水解 在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食品提供，故被种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食品提供，故被称为必需氨基酸，他们对人体有极其重要的生理作用。称为必需氨基酸，他们对人体有极其重要的生理作用。 蛋白质蛋白质胨胨肽肽氨基酸氨基酸凯氏定氮法凯氏定氮法杜马斯法杜马斯法福林酚法福林酚法染色法染色法（五）蛋白质的测定方法凯氏定氮法凯氏定氮法1.1.原理原理 样品与样品与浓硫酸和催化剂

8、浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱加碱，在氢氧化钠在氢氧化钠的作用下，的作用下，经水蒸气蒸馏使经水蒸气蒸馏使氨蒸出氨蒸出，用过量的，用过量的硼酸溶液吸硼酸溶液吸收后收后，再以盐酸或硫酸标准溶液滴定再以盐酸或硫酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量计，根据酸的消耗量计算算含氮量含氮量，并换算成，并换算成蛋白质含量蛋白质含量。 2NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6C

9、O2+12SO2+16H2O加硫酸钾加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点作为增温剂，提高溶液沸点加氧化剂加氧化剂 加速有机物氧化速度加速有机物氧化速度LOGO硫酸钾硫酸钾的作用的作用u 作为增温剂，作为增温剂，它与硫酸作用生成硫酸氢钾它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高可提高反应温度反应温度，而加快有机物分解，而加快有机物分解；u 一般纯硫酸的沸点在一般纯硫酸的沸点在3400C左右，而添加硫酸钾后，左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到可使温度提高到4000C以上，原因主要在于随着消以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解化过程中硫酸不断地被分解 ，水分不断逸出而使硫，水分不断逸出而使硫酸钾浓度

10、增大酸钾浓度增大 ，故沸点升高，其反应式如下：，故沸点升高，其反应式如下： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3LOGO但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：损失： （NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。来提高沸点，但效果不如硫酸钾。LOGO 硫酸铜的作用硫酸

11、铜的作用 催化剂催化剂 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反应不断进行，待有机物被消化完此反应不断进行，待有机物被消化完后，后，不不再有硫酸亚铜再有硫酸亚铜（褐色）（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。色。 可以指示可以指示消化消化终点的到达终点的到达消化具体操作消化具体操作准确称取样品，置于凯氏烧瓶中；准确称取样品，置于凯氏烧瓶中；加入硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸摇匀；加入硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸摇匀；置于电炉上，成置于电炉上，成4545度角，小火加热。度角，小火加

12、热。待泡沫停止后，加大火力，保持微待泡沫停止后，加大火力，保持微沸，至液体变蓝绿色透明，再继续沸，至液体变蓝绿色透明，再继续加热加热0.50.51h1h，取下冷却后，小心加入水，转移至取下冷却后，小心加入水，转移至1000ml1000ml容量瓶，定容，作为样品液容量瓶，定容，作为样品液备用，同时做空白试验。备用，同时做空白试验。l按图安装好微量定氮蒸馏装置;l于水蒸气发生瓶内装水装水至2/3容积处，加指示剂数滴及硫酸硫酸数毫升，以保持水呈，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。l在加入硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。 用硼酸吸收，用用硼酸吸收，用盐酸标准溶液盐酸标准溶液滴

13、定至滴定至灰色灰色为终点为终点 指示剂：混合指示剂（甲基红指示剂：混合指示剂（甲基红溴甲酚绿）溴甲酚绿） 指示剂指示剂 红色红色 绿色绿色 红色红色 （酸）（酸） （碱）（碱） （酸）（酸）2NH + 4H BO =(NH ) B O +5H O (NH ) B O +2HCl+5H O=2NH Cl+4H BO1000W%100K)(CMVVN21半微量凯氏定氮蒸馏装置半微量凯氏定氮蒸馏装置LOGO（1）测得的是粗蛋白含量（总氮量，含非蛋白氮）；测得的是粗蛋白含量（总氮量，含非蛋白氮）；（2）所用试剂应用所用试剂应用配制配制；（3）消化过程应注意消化过程应注意凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将凯氏烧瓶

14、，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。附在瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。（4）若样品含脂肪或糖较多时，）若样品含脂肪或糖较多时，消化时易产生大量泡消化时易产生大量泡沫，可加沫，可加少量辛醇或液体石蜡，或硅少量辛醇或液体石蜡，或硅油油消泡剂，并消泡剂，并注意适当控制热源强度注意适当控制热源强度（要小火加热）（要小火加热）。（5）若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶冷却，）若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶冷却，加入加入300g/L23ml后再加热。后再加热。注意事项注意事项LOGO（5）若取样量较大，如干试样超过若取样量较大，如干试样超过5 5g g，可按每克试样可按每

15、克试样5 5mlml的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。（6 6）消化时间一般约消化时间一般约4 4小时左右即可，消化时间过长小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失。会引起氨的损失。一般消化至透明后，继续消化一般消化至透明后，继续消化3030minmin即可，但当含有特别难以氨化的即可，但当含有特别难以氨化的氮氮化化合合物的样物的样品，品，如含赖氨酸或组氨酸时，消化时间需适当延长如含赖氨酸或组氨酸时，消化时间需适当延长，因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全，因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全，往往导致总氮量偏低往往导致总氮量偏低。有机物如分解完全，分解液。有机物如分解完

16、全，分解液呈蓝色或浅绿色。但含铁量多时，呈较深绿色呈蓝色或浅绿色。但含铁量多时，呈较深绿色。LOGO（7）蒸馏过程应注意接头处无）蒸馏过程应注意接头处无现象，蒸馏完毕，现象，蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，最后关闭电源，绝绝不能先关闭电源，否则吸收液将不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。发生倒吸。（8）不应超过不应超过40C，否则氨吸收否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。减弱，造成损失，可置于冷水浴中。（9）混合指示剂

17、在碱性溶液中呈）混合指示剂在碱性溶液中呈，在中性溶液中，在中性溶液中呈呈，在酸性溶液中呈，在酸性溶液中呈。LOGO自动凯氏定氮仪自动凯氏定氮仪特点：特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化多个样品，）快速：一次可同时消化多个样品， 消化时间短；消化时间短；（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，计算总氮百分含量并记录，12分钟完成分钟完成1个样。个样。LOGO 1、试述蛋白质测定中

18、，样品消化过程所必须注意试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？什么？ 2 2、样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？化，说明什么问题？须采用什么措施？ 3 3、硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？ 作作 业业氨基酸的测定氨基酸的测定Determination of amino acid in Food氨

19、基酸的测定方法氨基酸的测定方法 氨基酸分析仪法（国标法）氨基酸分析仪法（国标法） 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC)HPLC) 气相色谱法（气相色谱法（GC)GC) 荧光分光光度法荧光分光光度法 紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法氨基酸分析仪法氨基酸分析仪法1、原理、原理 利用氨基酸的利用氨基酸的酸碱性、极性和分子量大小不同酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，等性质，使用使用阳离子交换树脂阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色在色谱柱上进行分离。当样液加入色谱柱顶端后，采用谱柱顶端后，采用不同的不同的pHpH值和离子浓度的缓冲溶液值和离子浓度的缓冲溶液即可即可将它们依次

20、洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用将它们依次洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色茚三酮显色，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。定量依据：定量依据：是是氨基酸和茚三酮反应氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的生成蓝紫色化合物的颜色深浅颜色深浅与各有关与各有关氨基酸的含量成正比氨基酸的含量成正比。脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物，故需在另外波脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物，故需在另外波长处定量测定。长处定量测定。 氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪氨基酸分析仪法氨基酸分析仪法2. 操作方法操作方法 （1 1）样品处理：）样品处理：测定测定样品中样品中各种各种

21、游离氨基酸含量游离氨基酸含量，可，可以以除去脂肪等除去脂肪等杂质后，杂质后，直接上柱进行分析直接上柱进行分析。 测定测定蛋白质的氨基酸组成时样品蛋白质的氨基酸组成时样品必须必须经酸水解经酸水解，使蛋，使蛋白质完全变成氨基酸后才能上柱进行分析。白质完全变成氨基酸后才能上柱进行分析。酸水解的方法：酸水解的方法：称取经干燥的蛋白质样品盐酸，置于称取经干燥的蛋白质样品盐酸，置于110110 C C烘箱内水解烘箱内水解2424小时，然后除去过量的盐酸，加缓冲小时，然后除去过量的盐酸，加缓冲溶液稀释到一定体积，摇匀。取一定量的水解样品上柱溶液稀释到一定体积，摇匀。取一定量的水解样品上柱进行分析。进行分析。

22、 氨基酸分析仪法氨基酸分析仪法 如果样品中如果样品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂质，质，必须将样品预先除去杂质后再进行酸水解处理。去除必须将样品预先除去杂质后再进行酸水解处理。去除杂质的方法如下杂质的方法如下: : 去糖和淀粉去糖和淀粉：把样品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗：把样品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗涤，得蛋白质沉淀物；涤，得蛋白质沉淀物； 去脂肪：去脂肪：先把干燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机先把干燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机溶剂离心或过滤抽提，得蛋白质沉淀物；溶剂离心或过滤抽提，得蛋白质沉淀物； 去核酸：去核酸：将样品在将样品在

23、10%10%氯化钠溶液中，氯化钠溶液中，8585加热加热6 6小时，小时，然后用热水洗涤，过滤后将固形物用丙酮干燥即可；然后用热水洗涤，过滤后将固形物用丙酮干燥即可；去无机盐：样品经水解后含有大量无机盐时还必须用阳离去无机盐：样品经水解后含有大量无机盐时还必须用阳离子交换树脂进行去盐处理。子交换树脂进行去盐处理。氨基酸分析仪法氨基酸分析仪法（2 2）样品分析：）样品分析： 经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量视所经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量视所用自动分析仪的灵敏度而定。一般为每种氨基酸用自动分析仪的灵敏度而定。一般为每种氨基酸0.10.1 molmol左左右右( (水解样品

24、干重为水解样品干重为0.3mg0.3mg左右左右) )；生成的紫色物质在；生成的紫色物质在570nm570nm波长下进行比色测定。而生成的黄色化合物在波长下进行比色测定。而生成的黄色化合物在440nm440nm波长下波长下进行比色测定。进行比色测定。（3 3）结果计算：）结果计算： 根据峰出现的时间来确定氨基酸的种类。从峰的高度根据峰出现的时间来确定氨基酸的种类。从峰的高度和宽度可计算氨基酸的含量。和宽度可计算氨基酸的含量。用阳离子交换柱分离及测定氨基酸所得图谱如下：用阳离子交换柱分离及测定氨基酸所得图谱如下： 高效液相色谱法高效液相色谱法原理原理 蛋白质样品经酸或碱水解后，将氨基酸进行衍生化作蛋白质样品经酸或碱水解后，将氨基酸进行衍生化作用而溶解于流动相溶液中，采用高效液相色谱仪分离并用用而溶解于流动相溶液中，采用高效液相色谱仪分离并用荧光检测器进行测定，即可测定出各种氨基酸的含量。荧光检测器进行测定，即可测定出各种氨基酸的含量。高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差的物质和生物活性物质。的物质和生物活性物质。由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫外吸由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫外吸收检测器（收检测器（UVDUVD）和荧光检测器（）和荧光检测器（FDFD）又是）又是HPLCHPLC仪的最