肝豆状核变性课题汇报

1、1骨髓间充质干细胞对肝豆状核变性骨髓间充质干细胞对肝豆状核变性 肝纤维化治疗的临床研究肝纤维化治疗的临床研究 2主要研究开发内容主要研究开发内容 本研究采用分组对照临床试验方法，对骨髓间充质干细胞治疗HLD肝纤维化的安全性和有效性进行评价 检测多种肝纤维化指标及肝组织形态学病理改变；以观察自体骨髓间充质干细胞移植对肝纤维化病理进程的影响 为开展间充质干细胞治疗HLD肝纤维化提供试验依据 3申请项目的必要性和依据申请项目的必要性和依据 概述概述 肝豆状核变性（Hepatolenticular degeneration，HLD） 又称Wilson病（Wilson disease，WD），是一种难治

2、性的 常染色体隐性遗传铜代谢障碍疾病 由于铜在肝、脑等组织中异常沉积引起相应器官组织损 伤，临床以肝硬化、脑损害等相关症状为主要表现 临床症状复杂多样，但所有患者由于铜离子自胆道排泄障 碍，造成游离铜在肝组织长期缓慢蓄积导致不同程度的肝 脏慢性损害，肝纤维化几乎是每一个HLD患者肝脏的主要 病理改变4HLD流行病学调查流行病学调查 本病是较为常见的单基因遗传病，国外Ferenci P等流行病学调查，本病发病率为1/3万人，患病率为1525/10万人，杂合子为1/100人 国内刘焯霖等对19821991年神经遗传性疾病专科门诊统计分析，结果HLD占10.14，居全部单基因遗传病的第二位 我院统计

3、2010年7月2011年2月期间427例住院患者，约70%的患者在院外由于误诊误治导致病情加重，甚至因为肝硬化失代偿或/及严重脑损害导致残疾和死亡 申请项目的必要性和依据申请项目的必要性和依据 5申请项目的必要性和依据申请项目的必要性和依据 Ferenci P等等 胡纪源等胡纪源等 杨任民等杨任民等 HLD的病理研究证实患者均存在 明显的肝脏损害 绝大多数HLD患者存在着不同程度的肝纤维化声像学改变 HLD的肝纤维化是患者最常见的病理改变 肝硬化失代偿是本病患者致残、致死的最主要原因我们认为非常有必要对HLD的肝纤维化进行系统研究研究证实研究证实HLD患者均存在明显的肝脏损害患者均存在明显的肝

4、脏损害干预干预6申请项目的必要性和依据申请项目的必要性和依据 肝纤维化的病理机制肝纤维化的病理机制肝纤维化的形成涉及致病机体反应的多个方面 反应细胞 细胞因子 细胞过量表达产物以及降解酶等复杂的细胞及分子机制 ECM合成增加 ECM降解减少 致病因子使 肝组织中 窦内皮细胞 肝细 胞等 形成复杂的细胞-细胞因子网络 肝星状细胞激活 这些物质常被用作检测肝纤维化水平的血清标志物 HA LN PC-IV-CECM可被基质金属蛋白酶（MMPs）降解 基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs) 阻止肝脏ECM的降解 肝纤维化肝纤维化 吕有魁等临床观察到多数吕有魁等临床观察到多数HLD患者上述指标明显升高患者上

5、述指标明显升高 刘焯霖等观察到儿童HLD肝组织内TIMP-1、TIMP-2表达量增强7国内外有关文献在治疗国内外有关文献在治疗HLD肝纤维化现状肝纤维化现状 国内外有关文献在治疗HLD肝纤维化尚属空白，已报导的药物尚无一种被正式批准应用于临床抗肝纤维化，这是因为申请项目的必要性和依据申请项目的必要性和依据 某些药物虽具有抗肝纤维化作用，但其靶向性不强，对其它组织也有影响，长期应用副作用大许多药物早期或短期有预防作用，对已形成的肝纤维化疗效并不明显某些药物在某一环节有抗肝纤维化效果，但在其它环节又促进纤维化矛盾的作用 寻找有效治疗HLD肝纤维化的途径任重而道远却又迫在眉睫 8 干细胞干预肝纤维化

6、的研究现状干细胞干预肝纤维化的研究现状申请项目的必要性和依据申请项目的必要性和依据 Peresen 等Higashiyama R等Sakaida等 Aziz等 骨髓间充质干细胞及肝星状细胞，可诱导活化的肝星状细胞凋亡，明显减少胶原沉积 骨髓干细胞定植于肝脏，一部分表达基质金属蛋白酶，促进纤维条索的溶解而发挥抗纤维作用骨髓干细胞移至肝脏纤维条索周围 分泌MMP-2、914增多 细胞外基质及胶原条索降解增多有利肝功改善 通过将MSCs由尾静脉注入肝纤维化模型鼠内发现MSCs具有向肝细胞方向的转化及减轻肝纤维化的功能 MSCs移植具有抗肝纤维化作用9骨髓间充质干细胞治疗肝损害的优势骨髓间充质干细胞治

7、疗肝损害的优势骨髓间充质干细胞取材方便，来源丰富分化能力强免疫原性低没有伦理学障碍，不受道德及法律方面的限制具有跨胚层向多组织细胞分化的潜能和自我更新的高增值能力。申请项目的必要性和依据申请项目的必要性和依据 10本课题意义本课题意义 骨髓来源的间充质干细胞治疗肝豆状核变性导致的肝纤维化的安全性和有效性还需进一步的评估 探讨骨髓间充质干细胞移植治疗该病肝纤维化的机制也具有重要的意义申请项目的必要性和依据申请项目的必要性和依据 11实施方案实施方案采用临床试验方法，将病人分为三组: 青霉胺组 骨髓间充质干细胞移植干预组; 骨髓间充质干细胞移植干预加青霉胺组。 随访1-2年；治疗后3、6、9、12

8、个月观察患者日常生活能力评价、临床分级评价、细胞因子、基质金属蛋白酶、肝铜含量变化、治疗1年后肝组织活检进行病理检查，所得数据应用SAS处理。项目研究开发内容项目研究开发内容 12给药方案给药方案 青霉胺组：青霉胺(上海信谊制药公司生产)，剂量为每日40mg/kg，连续816周骨髓间充质干细胞移植干预：将3l06细胞/ml的骨髓间充质干细胞液2ml+生理盐水100ml经静脉移入人体。每10天静脉干细胞移植一次，三次为一个疗程骨髓间充质干细胞移植干预加青霉胺组：将3l06细胞/ml的骨髓间充质干细胞液2m+生理盐水100ml经静脉移入人体，每10天静脉干细胞移植一次，三次为一个疗程。另将青霉胺（

9、剂量为每日40mg/kg），每日分3次口服，连续816周项目研究开发内容项目研究开发内容 13标本收集标本收集分别于治疗后3、6、9、12个月抽取病人外周血1.2ml，用于细胞因子、基质金属蛋白酶、肝铜含量检测；治疗后1年进行肝脏组织病理检查项目研究开发内容项目研究开发内容 14观察指标与方法观察指标与方法取血1.2ml，血标本经低速冷冻离心(3000转/分)10分钟后取血清约0.5ml进行有关实验项目检测。如：血清生化、肝纤维化指标及相关细胞因子检测血清铜蓝蛋白采用免疫比浊法，ALT采用比色法，LN、HA采用放射免疫法(RIA)，PDGF、 TGF1、IL-10、TNF-、MMP-1及TIM

10、P-1采用ELISA法肝脏组织病理检查:肝脏标本均作连续切片，每份标本均行下述检查：普通HE染色、胶原纤维采用Masson氏染色、网状纤维采用Gomori染色 肝脏组织铜含量测定采用原子吸收分光光度法检测项目研究开发内容项目研究开发内容 15统计学分析统计学分析数据应用SAS处理，各组间比较采用one way ANOVA 分析项目研究开发内容项目研究开发内容 16关键技术关键技术 肝脏穿刺可能会给病人带来一定的痛苦和创伤，我们将请有经验的临床医生在彩超监测下进行活检 建立一套稳定的检测细胞因子、基质金属蛋白酶、肝铜含量方法直关重要。本实验室检测基质金属蛋白酶时，出现不稳定的现象，对于这一问题，

11、我们正请有关专家帮助建立稳定、可靠的方法项目研究开发内容项目研究开发内容 17 技术路线技术路线项目研究开发内容项目研究开发内容 18本项目的特色与创新之处本项目的特色与创新之处 首次应用人骨髓干细胞移植干预HLD患者，为开展骨髓干细胞移植治疗HLD肝纤维化提供新的 理论、实验依据项目研究开发内容项目研究开发内容 19已具备的试验手段已具备的试验手段 南方医科大学附属郑州人民医院2008年成立了院士工作站，并开展了干细胞治疗。与此相适应的投入一千万元建立了一个现代化试验室，配备了先进的试验设备。有能力提供高质量、高活性的细胞 该研究与我们刚获得的国家自然基金项目可以共享试验设备和人力资源，我们

12、又投入500多万元，购买了与试验相关的设备， 如ABI3730XL序列仪、高速冷冻离心机、流式细胞仪、PCR仪、分子生物学平台、高速离心机、悬涡振荡器，磁力搅拌器，PH计，立式高压消毒锅，微波炉等 院士工作站具备完成本课题所需的条件实施本项目已具备的条件实施本项目已具备的条件 20已具备的技术力量已具备的技术力量姓姓 名名性性 别别出生年月出生年月学学 历历职称（职务）职称（职务）从事专业从事专业工作单位及部门工作单位及部门张东锋男1976.10硕士主治医师神经内科郑州人民医院、脑科医院曹 巍男1963.01博士教 授分子病理郑州人民医院、院士工作站王大忠男1968.08硕士副主任医师神经内科郑州人民医院、脑科医院吴牵峰男1973.12硕士主治医师神经内科郑州人民医院、脑科医院刘 荣女1975.05博士副研究员 药理学郑州人民医院、院士工作站张 岩男1983.02学士住院医师神经内科郑州人民医院、脑科医院葛长勇男1970.02博士副研究员干细胞研究郑州人民医院、院士工作站实施本项目已具备的条件实施本项目已具备的条件 21项目的预期经济、社会和环境效益项目的预期经济、社会和环境效益通过以下三方面的研究 评价骨髓间充质干细胞治疗HLD患者的安全性和有效性（血常规、尿常规、肝肾功能） 探讨经人静脉骨髓间充质干细胞移植干预肝纤维化的病理过程 观察骨髓间充质干细胞