杞菊地黄丸定性检查及含量测定解读

1、 杞菊地黄丸定性检查及含量测定 前言：实验依据：有熟地之腻补肾水,即有泽泻之宣泄肾浊以济之;有英肉之温涩肝经,即有丹皮之清泻肝以佐之;有山药收摄脾经,即有获菩之淡渗脾湿以和之。药止六味,而大开大合,三阴并治,询补方之正鹊也”。本方配伍具有“三补”、“三泻”的特点,但中熟地黄用量是山萸肉、山药两药之和,且三辛佣明显重于三泻。枸杞和菊花增加了清肝明目的效果。现对杞菊地黄丸中各味药材进行定性鉴别和含量测定。 关键词;杞菊地黄丸；定性鉴别；含量测定； 1.地黄(鲜跃全) 定性鉴别（TLC法）实验仪器：超声发生器、研钵、烧杯、微量移液管、吹风机、研钵、烧杯、硅胶G薄层板、实验材料：杞菊地黄丸 熟地黄 泽

2、泻 茯苓 枸杞子 牡丹皮 山茱萸 山药细粉 菊花 实验试剂：乙酸乙酯、冰醋酸、10%硫酸、蒸馏水正丁醇、甲苯、冰醋酸、无水乙醇、10%硫酸、蒸馏水 试验方法 1.1供试品溶液的制备 取杞菊地黄丸(浓缩丸) 6g，研碎，加乙醇超声处理分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇使溶解，作为供试品溶液。 1.1.2供试品溶液的制备 称取颗粒剂2.2 g，研磨成细粉，加甲醇40 ml，超声振荡30 min。过滤。滤液浓缩至干,加乙酸乙酯2 ml溶解,得供试液。 1.2对照品的制备 另取毛蕊花糖苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。 1.3对照药材的制备 称取熟地黄浸膏粉0.5 g，按照供试

3、品溶液制备方法，制得熟地黄药材的对照液。 1.4阴性对照液的制备 按处方比例，取除去熟地黄以外的其余药材，同供试品溶液制备方法分别制成阴性对照液。称取泽泻0.75g、茯苓0.75g，30ml水加热回流提取1个小时，过滤，提取液浓缩至一定浓度；取枸杞子0.5g、牡丹皮0.75g,山茱萸1g和菊花0.5g，70%乙醇加热回流提取1个小时，过滤，浓缩成适当浓度；合并以上两种浓缩液，加山药细粉1g；加70%乙醇20 mL，加热回流提取1个小时，滤过，蒸干，加适量水溶解，分别用10ml乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为阴性对照溶液。 1.5薄层色谱法 1.5.1照薄层色谱法

4、中国药典(2010年版)附录YIB试验，吸取上述溶液各5uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯乙酸乙醋冰醋酸(24 : 8 : 1)为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰。 1.5.2薄层色谱照薄层色谱法中国药典(2010年版)附录YIB试验，吸取上述溶液各5uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水-甲醇(6332)为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰，显相同颜色的斑点且阴性对照液色谱在该位置上不显斑点。2.山药（周开放）【性味与归经】味甘，性平。归脾、肺、肾经。【功能与主治】补脾养胃，生津益肺，补肾

5、涩精。 实验材料：回流装置、冷凝装置、水浴锅、坩埚、烧杯、微量移液管、硅胶G薄层板、吹风机。 实验试剂：乙酸乙酯、甲醇、浓氨试液、无水乙醇、10磷钼酸。试验方法2.1供试品溶液的制备 取本品（杞菊地黄丸）粉末5g，加二氯甲烷30ml，加热回流2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。2.2对照品的制备 另取山药对照药材5g，同法制成对照药材溶液。对照药材加二氯甲烷同法制成对照药材溶液。2.3阴性对照液的制备 按处方比例，取除去山药以外的其余药材，同供试品溶液制备方法分别制成阴性对照液。 1.称取泽泻0.75g、茯苓0.75g和熟地黄2g，30ml水加热回流提取1个小时

6、，过滤，提取液浓缩至一定浓度； 2.取枸杞子0.5g、山茱萸1g、牡丹皮0.75g和菊花0.5g，70%乙醇加热回流提取1个小时，过滤，浓缩成适当浓度； 3.合并以上两种浓缩液;加70%乙醇20mL，加热回流提取1个小时，滤过，蒸干，加适量水溶解，分别用10ml乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为阴性对照溶液。2.5薄层色谱法试验 照薄层色谱法中国药典(2010年版)附录YIB试验，吸取上述溶液各5uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(9：1：0.5)为展开剂展开，取出，晾干，喷以10磷钼酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，

7、在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点且阴性对照液色谱在该位置上不显斑点。 3.茯苓（刘保松） 实验器材：50ml圆底烧瓶，冷凝管，蒸发皿，水浴锅，过滤装置，硅胶G薄层板，紫外检测仪，吹风机 实验材料：茯苓对照药材、杞菊地黄丸实验试剂：乙醚，甲醇，甲苯，乙酸乙酯，甲酸，2%香草醛硫酸溶液，乙醇。 3.1供试品溶液制备 取杞菊地黄丸浓缩丸6g，研碎，加乙醚50ml(量筒)，超声处理10分钟，滤过(滤纸，漏斗)，滤液蒸干(蒸发皿，水浴锅)，残渣加甲醇1ml使溶解(移液管)，作为供试品溶液。 3.2对照品药材制备 取茯苓对照药材1g，同法制成对照药材溶液。 3.3阴性对照溶液制备

8、 按处方比例，取除去茯苓以外的其余药材，同供试品溶液制备方法制成缺茯苓阴性对照液。3.4薄层色谱法试验 照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各2ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯一乙酸乙酯一甲酸(20 ：5 ：0.5)为展开剂(移液管)，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸溶液一乙醇(4：1)混合溶液，在105加热至斑点显色清晰(吹风机)。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。或者照薄层色谱法(中国药典20015年版中国药典)试验，吸取上述溶液各5uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯一乙酸乙酯一冰醋酸(24 : 8 : 1)为展开剂，展开，取出

9、，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。 4.泽泻（王金龙） 实验器材：氧化铝柱，水浴锅，蒸发皿，过滤装置，硅胶H薄层板，紫外检测仪，吹风机 实验材料：泽泻对照药材、杞菊地黄丸实验试剂：乙酸乙酯，23-乙酰泽泻醇B对照品，环己烷，乙酸乙酯，5%硅钨酸乙醇。 4.1供试品溶液制备 取杞菊地黄丸浓缩丸6g，研碎，加乙酸乙酯20 m1(量筒)，超声处理30分钟，滤过(滤纸，漏斗)，滤液加于氧化铝柱(200-300目，5g，内径为l cm，干法装柱)上，用乙酸乙酯10ml洗脱(移液管)，收集洗脱液，蒸干，残渣

10、加乙酸乙酯l ml(移液管)使溶解，作为供试品溶液。 4.2对照品药材制备 取泽泻对照药材1g，同法制成对照药材溶液。 4.3对照品溶液制备 另取23-乙酰泽泻醇B对照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。 4.4阴性对照溶液制备 按处方比例，取除去泽泻以外的其余药材，同供试品溶液制备方法制成缺泽泻阴性对照液。称取泽泻0.75g、熟地黄2g，30ml水加热回流提取1个小时，过滤，提取液浓缩至一定浓度；取枸杞子0.5g、山茱萸1g、牡丹皮0.75g和菊花0.5g，70%乙醇加热回流提取1个小时，过滤，浓缩成适当浓度；合并以上两种浓缩液，加山药细粉1g；加70%乙醇20 mL

11、，加热回流提取1个小时，滤过，蒸干，加适量水溶解，分别用10ml乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为阴性对照溶液。 4.5薄层色谱法试验 照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5ul，分别点于同一硅胶H薄层板上，以环己烷一乙酸乙酯(1 : 1）为展开剂(移液管)，展开，取出，晾干，喷以5%硅钨酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰(吹风机)。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。或者照薄层色谱法(中国药典20015年版中国药典)试验，吸取上述溶液各5uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯一乙酸乙酯一冰醋酸(24 : 8 : 1)

12、为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。 5.丹皮（雷铭宇） 仪器：加热回流装置、薄层板、紫外光灯材料：乙酸乙酯、蒸馏水、甲醇、牡丹皮对照药材、乙醚、丙酮、丹皮酚对照品、环己烷、盐酸、三氯化铁、乙醇定性鉴别（TLC法） 5.1 供试品溶液的制备 取本品15g（天平），研碎，加水100ml，加热回流3 0分钟，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯50ml（50ml量筒）振摇提取，分取乙酸乙酯液，蒸干（水浴锅），残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。 5.2对照药材溶液提取 取牡丹皮对照

13、药材1g（天平），研碎，加乙醚40ml，加热回流1 小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮lml（量筒）使溶解，作为供试品溶液。 5.3对照品溶液的制备 取丹皮酚对照品，加丙酮制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。 5.4阴性对照溶液的制备 取处方中除丹皮外的其余药味，称取泽泻0.75g、茯苓0.75g、熟地黄2g和山茱萸1g，30ml水加热回流提取1个小时，过滤，提取液浓缩至一定浓度（水浴锅）；取枸杞子0.5g和菊花0.5g，70%乙醇加热回流提取1个小时，过滤，浓缩成适当浓度；合并以上两种浓缩液，加山药细粉1g；加70%乙醇20 mL，加热回流提取1个小时，滤过，蒸干，加适量水溶解，分

14、别用10ml乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为阴性对照溶液。 5.5.1薄层条件 照薄层色谱法（通则0502)试验，吸取上述三种溶液各10ul分别点于同一硅胶G 薄层板上，使成条状，以环己烷-乙酸乙酯（3：1)为展开剂（层析缸），展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5 %三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的条斑。 5.5.2薄层板 硅胶薄层板20200.4,105 ,活化30备用;展开剂:-环乙烷-乙酸已酯-冰醋酸(1010.1);斑点观察:置紫外灯下(=254)检识定位5.6丹皮酚的含量测定 5.6

15、.1材料与方法 紫外分光光度计、 型电热恒温鼓风干燥箱 、紫外分析仪剂均为99.9%无水乙醇、水为二次蒸馏水 5.6.1.2材料 牡丹皮、丹皮酚对照品 5.6.1.3对照品标准溶液的制备 精确称取丹皮酚对照品0.005g置于 50ml烧杯中，以无水乙醇溶解 转至 100ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，得到 50ug/ml 的丹皮酚对照品溶液 5.6.1.4结果与分析5.6.1.4.1测定波长的选择 以无水乙醇为对照品，在274nm出测的最大波长 5.6.1.4.2线性关系考察 分别吸取对照品溶液0.5ml，1ml，1.5ml，2ml，2.5ml，3.0ml，3.5ml，4ml，置于2

16、5ml容量瓶中!，用无水乙醇稀释至刻度摇匀 。以无水乙醇为空白溶液在 274nm 波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标样品浓度为横坐标绘制标准曲线。 5.6.1.4.3丹皮酚含量测定 准确称取牡丹皮粉末 3.000g（分析天平），置于50ml锥形瓶中，加入25ml无水乙醇，60度恒温水浴2h，趁热过滤，置于25ml容量瓶中用无水乙醇溶液定容，作为供试品溶液。量取5份0.1ml牡丹皮供试品溶液分别置于25ml容量瓶中。用无水乙醇定容至刻度，摇匀，以无水乙醇为空白对照，于274nm波长处测定吸光度，测量三次，取平均值。丹皮酚含量测定结果如下表。吸光度检出量ug/ml平均检出量ug/ml丹皮酚含量 6

17、.菊花（邬学良）定性鉴别（TLC法）实验器材：水浴锅，超声提取仪，过滤装置，硅胶H薄层板,聚酰胺薄膜，紫外检测仪、锥形瓶、分析天平、回流装置、蒸发皿、5ml量瓶、25ml棕色量瓶实验材料：菊花，绿原酸供试品、杞菊地黄丸实验试剂：稀盐酸，乙酸乙酯，甲醇，乙醇，正丁醇，甲酸，冰醋酸、氯仿实验方法 6.1供试品溶液制备方法取本品杞菊地黄丸（浓缩丸），研细(过一号筛)取约1g，精密称定（分析天平）,置锥形瓶中,精密加人50甲醇50ml,称定重量,加热回流2小时,冷却,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取（10ml移液管）续滤液10ml,蒸干残渣加氯仿5ml,浸渍3分钟,弃去氯仿液,残

18、渣挥去氯仿（水浴，蒸发皿）,加水适量使溶解,并转移5ml棕色量瓶中,加水至刻度,摇匀,即得。 6.2对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50甲醇制成每1 ml含绿原酸35g的溶液，即得(10以下保存)。 6.3对照药材溶液制备 另取菊花对照药材粉末1g，同供试品溶液制法制成对照药材溶液。 6.4阴性对照溶液的制备 取处方中除菊花外的其余药味，按上述供试品溶液制备阴性对照溶液。称取泽泻0.75g、茯苓0.75g和熟地黄2g，30ml水加热回流提取1个小时，过滤，提取液浓缩至一定浓度；取枸杞子0.5g、牡丹皮0.75g和山茱萸1g，70%乙醇加热回流提取1个小时，过滤，

19、浓缩成适当浓度；合并以上两种浓缩液，加山药细粉1g；加70%乙醇20 mL，加热回流提取1个小时，滤过，蒸干，加适量水溶解，分别用10ml乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为阴性对照溶液。 6.5照薄层色谱法 6.5.1薄层板 薄层板：硅胶板H 乙酯-甲酸-冰醋酸-水(1：15：1：1：2)的上层溶液，乙酸乙酯-甲酸-水（7：2.5：2.5）的上层溶液，乙酸乙脂:甲酸:水:乙醇(1:1:1:0.2)上层液，乙酸乙酯-正丁醇-水（4:5:1）的上层溶液 6.5.2薄层板 聚酰胺薄膜板展开剂：36%乙酸吸取上述四种溶液各0.51l，分别点于同一硅胶板上，用展开剂，展开，

20、取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。7.山茱萸（陈明璐）实验仪器：加热回流装置、高效液相色谱仪、渗漏装置、吹风机、十八烷基硅烷键合硅胶实验材料：杞菊地黄丸、蒸馏水、乙酸乙酯、甲醇、山茱萸药材、熊果酸对照品、甲苯、乙酸乙酯、冰醋酸、磷酸、莫诺苷、马钱苷 7.1.供试品溶液的制备 取本品15g ，研碎，加水100ml ，加热回流 30 分钟，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯 50ml 振摇提取，分取乙酸乙酯液， 蒸干，残渣加甲醇 lml 使溶解，作为供试品溶液。 7.2对照药材溶液的制备 取山茱萸对照药材1g，加

21、乙醚 40ml，加热回流1小时，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯 lml 使溶解，作为对照药材溶液。 7.3样品溶液的制备 另取熊果酸对照品 ，加乙酸乙酯制成每lml 含 lmg的溶液，作为对照品溶液 7.4阴性对照品溶液的制备 按处方比例和制法制备不含山茱萸的阴性样品，制成阴性样品溶液。称取泽泻0.75g、茯苓0.75g和熟地黄2g，30ml水加热回流提取1个小时，过滤，提取液浓缩至一定浓度；取枸杞子0.5g、牡丹皮0.75g和菊花0.5g，70%乙醇加热回流提取1个小时，过滤，浓缩成适当浓度；合并以上两种浓缩液，加山药细粉1g；加70%乙醇20 mL，加热回流提取1个小时，滤过，蒸干，加适量

22、水溶解，分别用10ml乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为阴性对照溶液。 7.5定性检测 照薄层色谱法（通则0502 )试验，吸取鉴别（5 )项下的供试品溶液及上述对照药材溶液和对照品溶液各 5l，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯 - 冰醋酸（24 : 8 : 1) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10% 硫酸乙醇溶液，在 105C 加热至斑点显色清晰。供试品色谱中， 在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上， 显相同的紫红色斑点。 7.5山茱萸的含量测定 照高效液相色谱法（通则0512) 测定。色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充

23、剂； 以乙腈为流动相A，以0. 3 % 磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；莫诺苷和马钱苷检测波长为240nm，柱温为40C 。理论板数按莫诺苷、马钱苷峰计算均应不低于4000 。时间（分钟）流动相A（）流动相B（）0-55895925-2089220-35820928035-452060804045-556040 7.5.1.对照品溶液的制备 取莫诺苷对照品、马钱苷对照品对照品适量，精密称定，加7 0 % 甲 醇制成每lml中含莫诺苷与马钱苷各20 l的混合溶液，即得。 7.5.2.供试品溶液的制备 取重量差异项下的本品，研细，取约0 .3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入7

24、 0 % 甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷， 再称定重量， 用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 7.5.3含量测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10l，注入液相色谱仪，测定， 即得。 8.枸杞(李帅) 实验器材：水浴锅，离心机，回流装置（圆底烧瓶，冷凝管），抽滤装置（或漏斗），毛细管，层析缸，硅胶G薄层板，紫外检测仪，高相液相色谱仪实验试剂与材料：乙酸乙酯，冰醋酸，氯仿，甲苯，甲醇，甲酸，硫酸乙醇溶液，熊果酸对照品，杞菊地黄丸，枸杞子，山茱萸 薄层层析 8.1.供试品溶液的制备 取本品15g ，研碎，加水100ml ，加热回流 30 分钟，放冷，

25、离心，取上清液，用乙酸乙酯 50ml 振摇提取，分取乙酸乙酯液， 蒸干，残渣加甲醇 lml 使溶解，作为供试品溶液。 取本品粉末3.5g，加水煮沸，放冷，滤过，滤液用醋酸乙酯振摇提取，提取液浓缩至1ml，作为供试品溶液。 8.2对照药材溶液的制备 另取枸杞子对照药材 0.5g ，加水50ml，加热回流30 分钟，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯 30ml 振摇提取，分取乙酸乙酯液， 蒸干，残渣加甲醇 lml 使溶解，作为对照药材溶液。 8.3阴性样品溶液的制备 按处方比例和制法制备不含枸杞子的阴性样品，制成阴性样品溶液。称取泽泻0.75g、茯苓0.75g和熟地黄2g，30ml水加热回流提取1个

26、小时，过滤，提取液浓缩至一定浓度；取山茱萸1g、牡丹皮0.75g和菊花0.5g，70%乙醇加热回流提取1个小时，过滤，浓缩成适当浓度；合并以上两种浓缩液，加山药细粉1g；加70%乙醇20 mL，加热回流提取1个小时，滤过，蒸干，加适量水溶解，分别用10ml乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为阴性对照溶液。 8.4定性检测 8.4.1照薄层色谱法 （通则0502) 试验，吸取上述三种溶液各10l ，分别点于同一硅胶G 薄层板上， 以甲苯 - 乙酸乙酯 - 甲酸（15 : 2 : 1 )的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm)检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的斑点。8.4.2吸取上述三种溶液各5l，