【公开课课件】3.1重组DNA技术的基本工具课件2022学年高二下学期生物人教版选择性必修3

1、稀释涂布平板稀释涂布平板法法基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用通过精心设计用“分子工具分子工具”培育出了转基因番木培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNADNA双螺旋的直径只有双螺旋的直径只有2nm,2nm,对如此微小的分子进行操作，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需是一项非常精细的工作，更需要专门的要专门的“分子工具分子工具”。那么，。那么，科

2、学家究竟用到了哪些科学家究竟用到了哪些“分子分子工具工具”？这些？这些“分子工具分子工具”各各具有什么特征呢？具有什么特征呢？”切割切割”改造改造 “拼接拼接” 导入导入表达表达（1 1）所用的分子工具：限制性内切核酸酶、）所用的分子工具：限制性内切核酸酶、DNADNA连接连接酶，载体。酶，载体。（2 2）限制性内切核酸酶的特征：准确切割）限制性内切核酸酶的特征：准确切割DNADNA分子，分子，得到所需要的目的基因。得到所需要的目的基因。 DNADNA连接酶的特征：能将目的基因连接到载体上。连接酶的特征：能将目的基因连接到载体上。 载体的特征：能将目的基因导入受体细胞中。载体的特征：能将目的基

3、因导入受体细胞中。第第3 3章章 基因工程基因工程基因工程的理论基础：基因工程的理论基础：1. DNA1. DNA是遗传物质的证明；是遗传物质的证明；2. DNA2. DNA双螺旋结构的证明；双螺旋结构的证明；4.4.密码子的破译。密码子的破译。3. 3. 中心法则的确立；中心法则的确立； 基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNADNA

4、分分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNADNA技术。技术。（一）概念（一）概念 （1 1）原理：）原理：基因重组基因重组。 （2 2）操作水平：）操作水平：分子水平。分子水平。 （3 3）操作环境：）操作环境：生物体外。生物体外。 （4 4）操作对象：）操作对象：基因。基因。 （5 5）结果：）结果：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型 和生物制品。和生物制品。为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？基因是控制生物

5、性状的独立遗传单位。基因是控制生物性状的独立遗传单位。遗传信息的传递都遵循中心法则。遗传信息的传递都遵循中心法则。生物界共用一套遗传密码。生物界共用一套遗传密码。定向的改造生物遗传性状，定向的改造生物遗传性状，克服远缘杂交不亲和障碍。克服远缘杂交不亲和障碍。（6 6）意义）意义： 苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。 想一想需要做哪些关键工作？想一想需要做哪些关键工作？从人体细胞内提取从人体细胞内提取出出胰岛素基

6、因胰岛素基因胰岛素基因与胰岛素基因与载体载体DNADNA连接连接胰岛素基因导入受体胰岛素基因导入受体细胞细胞( (大肠杆菌大肠杆菌) )培育能产生人胰岛素的大肠杆菌培育能产生人胰岛素的大肠杆菌培育抗番木瓜环斑病毒的木瓜培育抗番木瓜环斑病毒的木瓜提取提取抗抗番木瓜番木瓜环斑病毒环斑病毒基因基因抗番木瓜环斑病毒抗番木瓜环斑病毒基因与载体基因与载体DNADNA连接连接抗抗番木瓜环斑病毒番木瓜环斑病毒基因导入受体细胞基因导入受体细胞重组重组DNADNA技术的基本工具：技术的基本工具：精确切割精确切割DNADNA分子的分子的“分子手术刀分子手术刀”、将将DNADNA片段再连接起来的片段再连接起来的“分子

7、缝合针分子缝合针”和将体外重组好的和将体外重组好的DNADNA分子导入受体细胞的分子导入受体细胞的“分子运输车分子运输车”。（一）、限制性内切核酸酶（一）、限制性内切核酸酶-“-“分子手术刀分子手术刀”12345 G12345 A2.2.限制性内切核酸酶（限制酶）的来源和作用限制性内切核酸酶（限制酶）的来源和作用作用：作用：能够能够识别双链识别双链DNADNA的特定核苷酸序列，的特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的并且使每条链中特定部位的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。（专一性专一性）来源：来源：主要从原核生物中分离纯化出来的。（主要从原核生物中分离纯化出来的。（有数千种，有数千种，现在已

8、经现在已经从约从约300300种微生物中分离出了约种微生物中分离出了约40004000种限制性内核酸切酶种限制性内核酸切酶( (限制酶限制酶) )）P P7171限制酶存在于原核生物中的作用？限制酶存在于原核生物中的作用？ 提示提示原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNADNA的入侵，但是，生的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNADNA侵侵入时，会利用限制酶将外源入时，会利用限制

9、酶将外源DNADNA切割掉，切割掉，但是不会切割自身的但是不会切割自身的DNADNA，以保证自身的安全。所以，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外限制酶在原核生物中主要起到切割外源源DNADNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。、使之失效，从而达到保护自身的目的。 限制酶识别序列的长度一般为限制酶识别序列的长度一般为4-84-8个或个或其他数量的核苷酸，最常见的为其他数量的核苷酸，最常见的为6 6个个核苷酸。核苷酸。思考：流感嗜血杆菌的思考：流感嗜血杆菌的d d菌株菌株( Haemophilus influenzae d )( Haemophilus influenzae

10、 d )中先后分离到中先后分离到3 3种限制酶，则分别命名为种限制酶，则分别命名为: :Hind、Hind、 Hind3.3.限制性内切核酸酶的种类和命名限制性内切核酸酶的种类和命名 限制酶的命名是根据细菌种类而定，以限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRIEcoRI为例为例: : E E：Escherichia (Escherichia (属属) co) co：coli (coli (种种) R) R：RY13 (RY13 (品系品系) ) I I：首先发现：首先发现 在此类细菌中发现的顺序在此类细菌中发现的顺序EcoEcoRR：大肠杆菌（：大肠杆菌（Escherichia coliEs

11、cherichia coli）R R型菌株中分离出的第一个限制酶；型菌株中分离出的第一个限制酶；SmaSma：粘质沙雷氏菌：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescensSerratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。中分离出的第一个限制酶。11 限制酶识别序列限制酶识别序列呈呈现碱基互现碱基互补对称，无论是补对称，无论是6 6个碱基还是个碱基还是4 4个个碱基，都可以找到一条中心轴线，碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链中轴线两侧的双链DNADNA上的碱基是上的碱基是反向对称重复反向对称重复排列的排列的 : :在切割部在切割部位，一条链位，一条链正向正向读的碱

12、基顺序与读的碱基顺序与另一条链另一条链反向反向读的顺序完全读的顺序完全一致一致。4.4.限限制酶的识别序制酶的识别序列及切割特点：列及切割特点： 限制酶识别序列的长度一般限制酶识别序列的长度一般为为4-84-8个或其他数量的核苷酸，个或其他数量的核苷酸，最常见的为最常见的为6 6个个核苷酸。核苷酸。DNADNA分子经限制酶切割产生分子经限制酶切割产生的的DNADNA片段末端通常有两种形式片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端黏性末端和平末端。下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）D DA AGAATTC BGAATTC BGGGGCCCC GGGGCCCC

13、 CTTAAG CCCCGGGG CTTAAG CCCCGGGG C CCTGCAG DCTGCAG DCTAAATCCTAAATCGACGTC GATTTAGGACGTC GATTTAG黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割: :EcoRIEcoRI限制酶限制酶伸出的伸出的核苷酸核苷酸互补配对互补配对黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶限制酶只能识别只能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开。之间切开。两种常用的限制酶：两种常用的限制酶：EcoR和SmaSmaISmaI限制酶限制酶只能识别只能识别CCCGGGCCC

14、GGG序列，并在序列，并在C C和和G G之间切开。之间切开。 当当SmaISmaI限制酶限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNADNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端平末端。SmaISmaI限制酶的切割限制酶的切割在在C C和和G G之之间切开间切开中轴线中轴线 大肠杆菌的一种限制酶大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)(EcoR)只能识别只能识别GAATTCGAATTC序列序列，并在，并在G G和和A A之间切开。之间切开。 粘质沙雷氏菌粘质沙雷氏菌的一种限制酶的一种限制酶SmaISmaI只能识别只能识

15、别CCCGGGCCCGGG序列，序列，并在并在C C和和G G之间切开。之间切开。1.1.被同一种限制酶切被同一种限制酶切断的几个断的几个DNADNA是否具有是否具有相同的黏性末端？相同的黏性末端？思考思考: :具有具有 不一定，但一般具有不一定，但一般具有不同的黏性末端。不同的黏性末端。2.2.被不同的限制酶切被不同的限制酶切断的几个断的几个DNADNA是否具是否具有相同的黏性末端？有相同的黏性末端？限制酶限制酶A A识别：识别：-AT-ATGATCGATCAT- AT- -TA-TACTAGCTAGTA-TA- ，切割位点是，切割位点是T T与与G G之间；之间；限制酶限制酶B B识别：识

16、别：-CA-CAGATCGATCTG- TG- -GT-GTCTAGCTAGAC-AC- ，切割位点是，切割位点是A A与与G G之间之间那么，它们那么，它们产生的粘性末端就相同产生的粘性末端就相同，都是都是: : GATC GATC 3.3.练习使用练习使用EcoEcoRIRI剪切目的基因剪切目的基因CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAAGATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT（1 1）该）该DNADNA片段上片段上EcoEcoRIRI的识别序列在哪儿？的识别序列在哪儿？（2 2）要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切要想获得某个特定性状的目的

17、基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性口？可产生几个黏性( (平平) )末端？末端？ 要切要切2 2个切口，产生个切口，产生4 4个黏性个黏性( (平平) )末端。末端。供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA限制酶限制酶目的基因目的基因（1)1)限制性内切核酸酶不切割自身限制性内切核酸酶不切割自身DNADNA的原因是原核生物中不存的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。（2)2)区别限制酶的特异性和专一性：区别限制酶的特异性和专一性：限制酶的特异性是指一种限制酶一般只能识别一种特定的核苷限制酶的特异性是指一种限制酶一般只能识

18、别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割酸序列，并在特定的位点切割DNADNA分子；分子；限制酶的专一性是指其只能切割限制酶的专一性是指其只能切割DNA,DNA,而不能作用于而不能作用于RNARNA、蛋白、蛋白质等其他底物。不同种类的限制酶识别的序列和切割的位点不同，质等其他底物。不同种类的限制酶识别的序列和切割的位点不同，这与酶的专一性是一致的。这与酶的专一性是一致的。( (3 3) )限制酶作用于磷酸二酯键，而不是氢键。限制酶作用于磷酸二酯键，而不是氢键。( (4 4) )限制酶是一类酶而不是一种酶。限制酶是一类酶而不是一种酶。 （5）在在切割含目的基因的切割含目的基因的DNADNA分子

19、时，需用限制酶切割分子时，需用限制酶切割2 2次，产次，产生生4 4个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的末端。个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的末端。限制酶相关知识巩固：限制酶相关知识巩固：基因的针线：基因的针线：DNADNA连接酶连接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用用EcoEcoRIRI切割切割DNADNA片段片段1 1DNADNA片段片段2 2重组重组DNADNA片

20、段片段1.DNA1.DNA连接酶的作用：连接酶的作用：酸酸磷酸二酯键磷酸二酯键 。种类种类来源来源特点特点E E. .colicoli DNADNA连接酶连接酶大肠杆菌大肠杆菌只能将具有互补黏性末端的只能将具有互补黏性末端的DNADNA片段连接起来，片段连接起来，不能连接具有平末端的不能连接具有平末端的DNADNA片段片段T4 T4 DNADNA连接酶连接酶T4T4噬菌体噬菌体既可以既可以“缝合缝合”双链双链DNADNA片段互补的黏性末端，片段互补的黏性末端，又可以又可以“缝合缝合”双链双链DNADNA片段的平末端，但连片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低接平末端的效率相对较低3.3.不同

21、生物的不同生物的DNADNA分子能拼接起来的原分子能拼接起来的原因因: :(1)DNA(1)DNA分子的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；分子的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；( (2)2)双链双链DNADNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构分子的空间结构都是规则的双螺旋结构；( (3)3)所有生物的所有生物的DNADNA碱基对均遵循严格的碱基对均遵循严格的“碱基互补配对原则碱基互补配对原则”。4.DNA4.DNA连接酶和限制酶的关系连接酶和限制酶的关系2.DNA2.DNA连接酶的种类：连接酶的种类：DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶相同点相同点作用实质作用实质化学本质化学本质不

22、不同同点点模板模板作用对象作用对象作用作用结果结果用途用途都能催化形成磷酸二酯键都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要DNADNA的一条链作模板的一条链作模板形成完整的重组形成完整的重组DNADNA分子分子形成形成DNADNA的一条链的一条链基因工程基因工程DNADNA复制复制只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连接连接到已有的到已有的DNADNA片段上，片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键在在两个两个DNADNA片段之间片段之间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键5.DNA5.DNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶的聚合酶的比较比较6.6.与与DNADNA相关的五种酶的比较相关

23、的五种酶的比较名称名称作用部位作用部位作用结果作用结果限制酶限制酶磷酸二酯键磷酸二酯键将将DNADNA切成两个片段切成两个片段DNADNA连接酶连接酶磷酸二酯键磷酸二酯键将两个将两个DNADNA片段连接为一个片段连接为一个DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶磷酸二酯键磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA (DNA (水解水解) )酶酶磷酸二酯键磷酸二酯键将将DNADNA片段水解为单个脱氧核苷酸片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶解旋酶碱基对之间的氢键碱基对之间的氢键将双链将双链DNADNA分子局部解旋为单链分子局部解旋为单链, ,形成两条长链形

24、成两条长链1.1.运载体需具备的条件运载体需具备的条件（1 1）（2 2）有一个至多个限制酶切点）有一个至多个限制酶切点（3 3）有某些标记基因）有某些标记基因（4 4）对受体细胞无害、易分离）对受体细胞无害、易分离能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达便于与不同目的基因结合便于与不同目的基因结合便于鉴定和筛选便于鉴定和筛选有标记基因的有标记基因的存在，可用含存在，可用含青霉素的培养青霉素的培养基鉴别。基鉴别。有切割有切割位点位点能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制2.2.质粒作为载体所具备的条件及原因质粒作为载体所具备的条

25、件及原因稳定存在并能自我复制或整合稳定存在并能自我复制或整合到受体到受体DNADNA上上有一个至多个限制酶切割位点有一个至多个限制酶切割位点供外源供外源DNADNA片段片段( (基因基因) )插入其中插入其中具有特殊的标记基因具有特殊的标记基因无毒害作用无毒害作用氨苄青霉氨苄青霉素抗性基素抗性基因因目的基因目的基因插入位点插入位点复制原点复制原点3 3运载体的种类：运载体的种类：4 4常用载体常用载体质粒质粒(1)(1)本质：本质：(2)(2)作用作用拟核拟核DNDNA A质粒质粒大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞质粒质粒( (最常用）最常用）、噬菌体（、噬菌体（噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物）、动植物病

26、毒等。）、动植物病毒等。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核核或原核细胞拟核DNADNA之外，并具有自我复制能力的之外，并具有自我复制能力的环状双链环状双链DNADNA分子。分子。作为运输工具，将外源基因导入细胞。作为运输工具，将外源基因导入细胞。质粒携带外源质粒携带外源DNADNA片段在细胞内大量复制或整合到受片段在细胞内大量复制或整合到受体体DNADNA上，随受体上，随受体DNADNA同步复制。同步复制。如：四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因如：四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因 真正被用作载体的质粒，都是在真正被用作

27、载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的天然质粒的基础上进行过人工改造的标记基因对重组标记基因对重组DNADNA的鉴定和选择原理的鉴定和选择原理标记基因通常有标记基因通常有: :抗生素的抗性基因抗生素的抗性基因，如，如: : 抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因(amp(ampr r) )、抗四环素基因、抗四环素基因(tet(tetr r) )荧光蛋白基因荧光蛋白基因，如，如: : 绿色荧光蛋白基因绿色荧光蛋白基因(GFP)(GFP)、红色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因(RFP)(RFP)重组重组DNADNA导入受体细胞不是导入受体细胞不是100%100%，而且导入率较低，而且导入率较低

28、 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：被导入了载体的受体细胞。如图所示：重组重组DNADNA分子分子用用EcoRIEcoRI限制酶切割下列两段限制酶切割下列两段DNADNA序列序

29、列: :5 -ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC- 33 -TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG- 55-TCCTAGAATT CTCGGTATGAATTCCATAC- 33-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG- 55 -ATAGCATGCTATCCATGAATTCCATAC- 33 -TATCGTACGATAGGTACTTAAGGTATG- 55533 ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG目的基因目的基因 TCCTAG AGGATCTTAA

30、 AATTCCATAC GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG 重组重组DNADNA分子分子 AATTCGGCATAC TATCGTACGATAGGTACTTAA ATAGCATGCTATCCATGGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGCCGTATG目的基因目的基因 TCCTAG AGGATCTTAA AATTCCATAC GGTATG 剪刀代表限制酶，透明胶条代表剪刀代表限制酶，透明胶条代表DNADNA连接酶。连接酶。 可能是剪切位点或连接位点的选择不对（也可能是其他原可能是剪切位点或连接位点的选择不对（也可能是其他原因）。比如在书写将要重组的两个因

31、）。比如在书写将要重组的两个DNADNA分子时，一般要求有同一分子时，一般要求有同一种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末端，否则黏性末端不同，碱基就无法配对。端，否则黏性末端不同，碱基就无法配对。 不能。真正的基因是有遗传效应的不能。真正的基因是有遗传效应的DNADNA片段，且含有几百至片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。几千个不等的碱基对。DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定一、一、实验原理：实验原理：1 1提取提取DNADNA的原理的原理 利用利用DNADNA与与RNARNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方

32、面的差、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取异，提取DNADNA，去除其他成分。，去除其他成分。如：如：(1)DNA(1)DNA在酒精溶液中的溶解性：在酒精溶液中的溶解性：DNADNA不溶于酒精，不溶于酒精，但某些蛋但某些蛋白质溶于酒精。白质溶于酒精。(2)DNA(2)DNA在在NaClNaCl溶液中的溶解性：溶液中的溶解性：DNADNA在不同浓度的在不同浓度的NaClNaCl溶液中的溶液中的溶解度不同，它溶解度不同，它能溶于能溶于2mol/L2mol/L的的NaClNaCl溶液溶液。2 2鉴定鉴定DNADNA的原理的原理 在一定温度下，在一定温度下，DNADNA遇二苯胺试剂会呈现蓝

33、色遇二苯胺试剂会呈现蓝色。1.1.了解了解DNADNA的物理和化学性质，理解的物理和化学性质，理解DNADNA粗提取和鉴定的原理；粗提取和鉴定的原理；2.2.学会学会DNADNA粗提取的方法以及用二苯胺试粗提取的方法以及用二苯胺试剂对剂对DNADNA进行鉴定。进行鉴定。 DNADNA含量相对较高含量相对较高的生物组织，如的生物组织，如新鲜洋葱新鲜洋葱、香蕉、菠菜、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。菜花和猪肝等。1.1.材料材料：2.2.用具用具：研磨液（研磨液（含有含有NaClNaCl、洗涤剂）、洗涤剂）、体积分数为体积分数为95%95%的的酒精（酒精（析出析出DNADNA）2mol/L 2mol/L

34、 的的NaClNaCl溶液（溶液（溶解溶解DNADNA）、）、二苯胺试剂（二苯胺试剂（鉴定鉴定DNADNA，要现配现用，要现配现用）蒸馏水）蒸馏水烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。1 1称取称取约约30 g30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL10 mL研磨液，充分研磨。研磨液，充分研磨。2 2去除滤液中的杂质去除滤液中的杂质（在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在在漏斗

35、中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4 4 冰箱中放置几分钟后，再取上清液或直接将研磨液倒入塑料离心管中，冰箱中放置几分钟后，再取上清液或直接将研磨液倒入塑料离心管中，在在1 500 r/min1 500 r/min的转速下离心的转速下离心5 min5 min，再取上清液放入烧杯中）。，再取上清液放入烧杯中）。3.DNA3.DNA的析出的析出 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液( (体积分数为体积分数为95%)95%)，静置，静置2 23 3 minmin，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNADNA；用玻

36、璃棒沿一个方向搅拌，；用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。将溶液倒入塑料离心管中，在卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。将溶液倒入塑料离心管中，在10 000 10 000 r/minr/min的转速下离心的转速下离心5 min5 min，弃上清液，将管底的沉淀物，弃上清液，将管底的沉淀物( (粗提取的粗提取的DNA)DNA)晾干。晾干。4.DNA4.DNA的鉴定的鉴定 取两支取两支20 mL20 mL的试管，各加入的试管，各加入2 mol/L2 mol/L的的NaClNaCl溶液溶液5 mL5 mL。将丝状物或沉淀物溶解于其中一支试管的。将丝状物或沉淀物溶解于其中一支

37、试管的NaClNaCl溶液中，再向两支试管中加入溶液中，再向两支试管中加入4 mL4 mL的二苯胺试剂。混的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min5 min，待试管冷，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。鉴定鉴定DNADNA鉴定鉴定结果结果 1.1.你提取出白色丝状物或你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？定的结果如何？ 2. 2.你能分析出粗提取的你能分析出粗提取的DNADNA中可能含有哪些杂质吗？中可能含有哪些杂质吗？ 了解实验室提取纯度较了解实验室提取

38、纯度较高的高的DNADNA的方法。的方法。实验梳理实验梳理第一次过滤获得第一次过滤获得DNADNA的滤液的滤液第二次过获得第二次过获得DNADNA粘稠物粘稠物第三次过滤获得第三次过滤获得DNADNA的滤液的滤液获得含获得含DNADNA的滤液的滤液 获取获取DNADNA粘稠物粘稠物 得到含得到含DNADNA的滤液的滤液 第一次：用第一次：用0.14 mol/L0.14 mol/L的的NaCINaCI溶液析出溶液析出DNADNA，目的是除去溶液中的杂质。，目的是除去溶液中的杂质。第二次：用冷却的第二次：用冷却的9595的酒精，获得含杂质较少的的酒精，获得含杂质较少的DNADNA丝状物。丝状物。注意

39、事项注意事项6 6加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的放出的DNADNA量就会减少。量就会减少。7 7预冷的酒精具有以下优点：可抑制核酸水解酶的活性，进而预冷的酒精具有以下优点：可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制抑制DNADNA降解；抑制分子运动，使降解；抑制分子运动，使DNADNA易形成沉淀析出；低温易形成沉淀析出；低温有利于增加有利于增加DNADNA分子的柔韧性，减少其断裂。分子的柔韧性，减少其断裂。课堂检测课堂检测1.1.质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述不正确的是质粒是基因工程中最常用的目的

40、基因运载工具。下列有关叙述不正确的是( () )A A质粒是不只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链质粒是不只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNADNA分子分子B B在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点C C携带目的基因的重组质粒整合到宿主细胞的染色体携带目的基因的重组质粒整合到宿主细胞的染色体DNADNA上会随后者的复制而上会随后者的复制而复制复制D D质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNADNA的鉴定和选择的鉴定和选择质粒不只分布于原核生物中，在真核生物质粒不只分布于原核生物中

41、，在真核生物酵母菌细胞内也有分布，酵母菌细胞内也有分布，A A正确；并不是正确；并不是所有的质粒都能找到限制酶的切割位点，从而成为合适的运载目的基因的工具，所有的质粒都能找到限制酶的切割位点，从而成为合适的运载目的基因的工具，B B错误；错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制，重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制，C C正确；质粒正确；质粒上的抗性基因常作为标记基因，上的抗性基因常作为标记基因，D D正确。正确。B2.2.下列有关下列有关“DNA“DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定”实验原理的叙述，正确的是实验原理的叙述，正确的是( ()

42、 )A ADNADNA在在NaClNaCl溶液中的溶解度随溶液中的溶解度随NaClNaCl溶液浓度的升高而减小溶液浓度的升高而减小B B利用利用DNADNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNADNAC CDNADNA是大分子有机物，易溶于水也溶于某些有机溶剂是大分子有机物，易溶于水也溶于某些有机溶剂D D在沸水浴中，在沸水浴中，DNADNA遇二苯胺会出现紫色反应遇二苯胺会出现紫色反应B随随NaCl溶液浓度的升高，溶液浓度的升高，DNA的溶解度先降低后增大，的溶解度先降低后增大，A错误；错误；DNA不溶于酒精等不溶

43、于酒精等有机溶剂，有机溶剂，B正确；在沸水浴条件下，正确；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺后呈现蓝色，遇二苯胺后呈现蓝色，D错误。错误。3.3.下列关于基因工程的有关叙述，正确的是下列关于基因工程的有关叙述，正确的是( )( )A.A.基因工程常用的工具酶是限制酶、基因工程常用的工具酶是限制酶、DNADNA连接酶、载体连接酶、载体B.B.一种限制酶能识别几种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割一种限制酶能识别几种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNADNAC.C.质粒是一种常用载体，是拟核或细胞核外能自主复制的很小的环状质粒是一种常用载体，是拟核或细胞核外能自主复制的很小的环状DNADN

44、A分子分子D.DNAD.DNA连接酶可代替连接酶可代替DNADNA聚合酶用于聚合酶用于DNADNA的复制的复制 4.4.以下关于基因工程操作工具的叙述，正确的是以下关于基因工程操作工具的叙述，正确的是( )( )A.DNAA.DNA连接酶能够催化核糖核苷酸之间形成磷酸二酯键连接酶能够催化核糖核苷酸之间形成磷酸二酯键B.B.限制酶能识别并切割限制酶能识别并切割DNADNA分子内一段特定的核苷酸序列分子内一段特定的核苷酸序列C.C.质粒一般具有复制原点、酶切位点和抗生素合成基因等质粒一般具有复制原点、酶切位点和抗生素合成基因等D.DNAD.DNA聚合酶可将目的基因和载体连接形成重组聚合酶可将目的基

45、因和载体连接形成重组DNADNACB5 5限制酶限制酶a a和和b b的识别序列和切割位点如图所示下列有关说法错误的是（）的识别序列和切割位点如图所示下列有关说法错误的是（）A Aa a酶与酶与b b酶切断的化学键相同酶切断的化学键相同B B能被能被b b酶识别并切割的序列也能被酶识别并切割的序列也能被 a a切割切割C C在相同的在相同的DNADNA分子中分子中a a酶的识别位点一般明显要比酶的识别位点一般明显要比b b酶多酶多D D将大量将大量a a酶和酶和b b酶切割后的片段混合，重新连接后的酶切割后的片段混合，重新连接后的DNADNA片片段不一定全都能被段不一定全都能被a a切割切割D

46、 D6.6.如图为如图为DNADNA分子的某一片段分子的某一片段, ,其中其中分别表示某种酶的作用部位分别表示某种酶的作用部位, ,则相应则相应的酶依次是的酶依次是( () ) A.DNAA.DNA连接酶、限制酶、解旋酶连接酶、限制酶、解旋酶B.B.限制酶、解旋酶、限制酶、解旋酶、DNADNA连接酶连接酶C.C.限制酶、限制酶、DNADNA连接酶、解旋酶连接酶、解旋酶D.D.解旋酶、限制酶、解旋酶、限制酶、DNADNA连接酶连接酶【解析】【解析】选选D D。是氢键是氢键, ,是解旋酶的作用位点是解旋酶的作用位点; ;是磷酸二酯键是磷酸二酯键, ,限制酶可将其限制酶可将其断裂断裂; ;是是DNA

47、DNA连接酶连接酶, ,可将可将DNADNA片段之间的磷酸二酯键连接起来。片段之间的磷酸二酯键连接起来。7.7.某线性某线性DNADNA分子含有分子含有50005000个碱基对（个碱基对（bpbp），先用限制酶），先用限制酶a a切割，再把得到切割，再把得到的产物用限制酶的产物用限制酶b b切割，得到的切割，得到的DNADNA片段大小如表所示。限制酶片段大小如表所示。限制酶a a和和b b的识别序的识别序列和切割位点如图所示。下列叙述错误的是列和切割位点如图所示。下列叙述错误的是( )( ) 酶a切割产物（bp）酶b再次切割产物（bp）2100；1400；1000；5001900；200；80

48、0；600；1000；500A.A.酶酶a a与酶与酶b b切断的化学键相同切断的化学键相同B.B.酶酶a a与酶与酶b b切出的黏性末端能相互连接切出的黏性末端能相互连接C.C.酶酶a a与酶与酶b b在该在该DNADNA分子上的切割位点数分别为分子上的切割位点数分别为3 3个和个和5 5个个D.D.限制酶将限制酶将1 1个个DNADNA分子片段切成分子片段切成2 2个片段需消耗个片段需消耗2 2个水分子个水分子C 8. 8. 图甲是含有目的基因的外源图甲是含有目的基因的外源DNADNA片段，图乙是用于将目的基因导入片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），

49、相关限制酶的作用受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。（1 1）上述操作中不宜选用）上述操作中不宜选用Sma Sma I I，原因是，原因是Sma Sma I I会破坏会破坏_和和_。（2 2）在基因工程的操作中，不宜选用）在基因工程的操作中，不宜选用EcoR IEcoR I，原因是用，原因是用EcoR IEcoR I切割切割外源外源DNADNA片段后，片段后， _ _。目的基因目的基因抗性基因抗性基因目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中一、概念检测一、概念检测1. DNA1. D