第四章 海洋多糖

1、第四章 海洋多糖polysaccharide 韩韩 亮645586)浙江工业大学精细化工研究所海洋药物学（海洋药物学（Marine Pharmacology）糖概述糖概述单单 糖糖多多 糖糖Saccharides (or Carbohydrates): 糖类糖类; 碳水化合物碳水化合物衣，食，住，行衣，食，住，行 息息相关息息相关Starch (淀粉）：淀粉）：polysaccharidesPaper:cellulose(纤维素）纤维素）Sucrose(蔗糖）蔗糖）:disaccharides植物的光合作用：植物的光合作用：CO2 + H2OSaccharideCar

2、bohydrate?Glucose(CH2O)6Cn(H2O)mu结构与保护作用：纤维素、几丁质、果胶结构与保护作用：纤维素、几丁质、果胶u能量来源：葡萄糖、淀粉、糖原，能量来源：葡萄糖、淀粉、糖原，ATPu复杂的生物学功能复杂的生物学功能 重要的生命物质重要的生命物质 影响蛋白质的折叠、溶解、半衰期、抗原性、影响蛋白质的折叠、溶解、半衰期、抗原性、 生物活性；生物活性； 信息分子参与生命活动中的各种识别和信号转导；信息分子参与生命活动中的各种识别和信号转导；u糖类药物糖类药物 (Carbohydrate Drugs)糖类的生物作用血型物质与血型决定簇血型物质与血型决定簇A型型: Y=NHAc

3、B型型: Y= OHAB性性: Y=NHAc or Y=OH O型型ProteinOOOOOOHOHHOYOHOHOHHOOHH3CONHAcHOOHOXProteinOOOOHOHOHHOOHH3CONHAcHOOHOXHO血型血型 ？红细胞膜脂或膜蛋白中的糖基红细胞膜脂或膜蛋白中的糖基 OOSO3-HOHO-O3SHNOOHO2CHOOHOOOSO3-O3SHN-O3SOOOHOCO2HOSO3-OOHOOSO3-O3SHNOMe肝素五糖 ( Heparin Pentasaccharide)OHHOHOOHHNOH3CHOOHOOOHHOOHOOOHHOOHOH阿卡波糖 (Acarbose

4、)OOOOOOSO2NH2 托吡酯 (Topiremate)糖类药物糖类药物 (Carbohydrate Drugs)胰岛素及其他影响血糖药胰岛素及其他影响血糖药 抗癫痫药物抗癫痫药物OR1R1NH2NH2OH2NHONHR2OOOHHOH2NOH卡那霉素 (Kanamycin ) R1=OH, R2=H敌拜卡霉素 (Dibekacin) R1=H, R2=H阿拜卡霉素 (Arbelkacin) R1=H, R2=COCH(OH)CH2CH2NH2OHOHOOHAcHNCO2HHNNH2NHRelenzaOOHHOHOOOMeHOHOOHOOHOOHAcHNOOHOOHOHOOHOOHHOOC

5、eramideGlobo H 抗原OCO2HOHOAcHNHOHOOHHOOHOOHAcHNOOOHOHOOHOOHHOOCeramideGanglioside GM2糖类药物糖类药物 (Carbohydrate Drugs)抗病毒药抗病毒药 单糖单糖Monosaccharides双糖双糖Disaccharides寡糖寡糖Oligosaccharides醛糖醛糖酮糖酮糖丁糖丁糖戊糖戊糖己糖己糖丙糖丙糖多糖多糖Polysaccharides糖类化合物糖类化合物糖类化合物的分类糖类化合物的分类糖概述糖概述单单 糖糖多多 糖糖单糖CHOCOHHCHHOCOHHCOHHCH2OH*葡萄糖葡萄糖果糖果糖

6、开链结构及构型开链结构及构型具有多个手性中心具有多个手性中心2n分子有旋光分子有旋光CH2OHCOCHHOCOHHCOHHCH2OH*开链结构式的表示开链结构式的表示Fischer 投影式投影式上上下下（氧化态）（氧化态）高高低低一对对映体一对对映体D-GlucoseL-GlucoseCHOCOHHCHHOCOHHCOHHCH2OH123456CHOCHHOCOHHCHHOCHHOCH2OH123456甘油醛甘油醛：糖构型表示法糖构型表示法D/L-与甘油醛比较与甘油醛比较D-GlucoseL-GlucoseCCHOOHHCH2OHCCHOHHOCH2OHD-(+)-Glyceraldehyde

7、L-(-)-GlyceraldehydeCHOCOHHCHHOCOHHCOHHCH2OHCHOCHHOCOHHCHHOCHHOCH2OHD-， L-型糖互为一对型糖互为一对对映体对映体自然界存在的糖大多数都是自然界存在的糖大多数都是D-型型D-, L- 只用在糖、只用在糖、 -氨基酸、氨基酸、 -羟基酸的构型表示羟基酸的构型表示CHOCHHOCHHOCOHHCOHHCH2OHD-葡萄糖葡萄糖D-GlucoseD-甘露糖甘露糖D-MannoseCHOCOHHCHHOCOHHCOHHCH2OHD-葡萄糖葡萄糖D-GlucoseCHOCOHHCOHHCOHHCOHHCH2OHCHOCOHHCHHOC

8、OHHCOHHCH2OHD-阿洛糖阿洛糖D-AlloseCHOCOHHCHHOCOHHCOHHCH2OHCHOCOHHCHHOCHHOCOHHCH2OHD-葡萄糖葡萄糖D-GlucoseD-半乳糖半乳糖D-Galactose非对映异构体非对映异构体差向异构体：差向异构体：在立体化学中，在立体化学中，含有多个手性碳原子的立体异构体含有多个手性碳原子的立体异构体中，只有一个手性碳原子的构型不中，只有一个手性碳原子的构型不同，其余的构型都相同的非对映体。同，其余的构型都相同的非对映体。 一些实验现象一些实验现象RCHO2CH3OHCHROCH3OCH3dry HCl+C6H12O6CH3OHdry

9、HCl+(C6H12O5)OCH3缩醛缩醛acetalGlucose 熔点熔点146配成水溶液配成水溶液 +112 Glucose 熔点熔点148150配成水溶液配成水溶液 +18.7 +52.7(1)(2)IR 中无羰基吸收峰中无羰基吸收峰, 1H NMR中无醛基氢吸收峰中无醛基氢吸收峰(3)变旋现象变旋现象Mutarotation环状环状结构及构型结构及构型如何解释变旋现象如何解释变旋现象( Mutarotation)？糖中的糖中的-CHO不是游离不是游离的，而是以的，而是以半缩醛半缩醛的形式存在。的形式存在。CHOCOHHCHHOOHHCOHHCH2OHOOHOHOHOHHOOOHOHO

10、HOHHO -D-(+)-Glu +112m.p. 146C -D-(+)-Glu +18.7m.p. 150C开链开链D-(+)-Glu36.4%0.5%63.6% (+112) 36.4% + (+18.7) 63.6% = 52.7环状结构的表示方式环状结构的表示方式OHOHOHOHCH2OHOHCHOCOHHCHHOOHHCOHHCH2OHHOH2CCHHCCHHCCHOHOHOHOHOOHOHOHOHCH2OHOH OOHOHOHOHHOOOHHOOHOHHO顺转顺转90 碳链卷曲碳链卷曲C4-C5旋转旋转120 Fischer投影式投影式Haworth投影式投影式 -D-(+)-G

11、lu -D-(+)-GluHaworth式的书写规律lO在后面，在后面，C-1在右边时（最常用的写法），在右边时（最常用的写法），所有所有D-型糖的型糖的CH2OH均向上均向上，L-型则均向下型则均向下l对对-D-型糖，型糖，C1-OH向向下下；对；对-D-型糖，型糖，C1-OH向向上上。L-型糖则与型糖则与D-型糖恰恰相反。型糖恰恰相反。lFischer式中在垂直碳链式中在垂直碳链右边的羟基右边的羟基，在，在Haworth式中则向式中则向下下；Fischer式中在垂直碳链式中在垂直碳链左边的羟基左边的羟基，在在Haworth式中则向式中则向上上-D-吡喃葡萄糖吡喃葡萄糖-D-吡喃葡萄糖吡喃葡

12、萄糖OOHHOOHOHHOOOHOHOHOHHOOHOHOOHOHOHOHOHOHOHOCH2OHOHOHOHOHOCH2OH-D-呋喃葡萄糖呋喃葡萄糖-D-呋喃葡萄糖呋喃葡萄糖六元环六元环五元环五元环OHOHOOHOHOH吡喃糖椅式构象中，吡喃糖椅式构象中，取代基占平伏键位取代基占平伏键位置越多，构象越稳定置越多，构象越稳定糖苷glycosideOOHHOHOOHOHOOHHOHOOHOCH2CH3OOHHOHOOHOCH2CH3CH3CH2OHH+糖苷键糖苷键糖苷：也称糖苷：也称配糖体配糖体，是单糖或寡糖的，是单糖或寡糖的半缩醛羟基半缩醛羟基与另一与另一分子中的羟基、氨基、或巯基等分子中的

13、羟基、氨基、或巯基等失水失水而生成的化合物而生成的化合物熊果苷熊果苷尿道消毒尿道消毒皮肤增白剂皮肤增白剂黑芥子苷黑芥子苷祛痰、理气等祛痰、理气等药物的原料药物的原料苦杏仁苷苦杏仁苷毒性毒性OOHOOHOHHOOOHOOHOHOOOHOOHOHOH甜菊苷甜菊苷OOHOOHOHHOOHOOHSOHOHHOCOCH2CH=CH2OOHOOHOHHOOOHOOHOHCHCN双 糖 一个单糖分子中的半缩醛羟基与另一个单糖分子一个单糖分子中的半缩醛羟基与另一个单糖分子中的羟基失水所得的糖中的羟基失水所得的糖OOHHOHOOHOOOHOHHOOHOOHHOHOOHOOOHHOOHOH麦芽糖麦芽糖蔗糖蔗糖-1

14、,4-糖苷键糖苷键-1,2-糖苷键糖苷键 -D-呋喃果糖基呋喃果糖基- -D-吡喃葡萄糖苷吡喃葡萄糖苷4-O-(-D-吡喃葡萄糖基）吡喃葡萄糖基）-D-吡喃葡萄糖吡喃葡萄糖糖概述糖概述单单 糖糖多多 糖糖多 糖u概述概述u理化性质理化性质u提取与分离提取与分离u结构鉴定结构鉴定u海洋中的多糖海洋中的多糖 多 糖 概 述 多糖多糖(polysacchrides)是来源于高等动植物细胞膜、是来源于高等动植物细胞膜、微生物细胞壁中的天然微生物细胞壁中的天然大分子大分子物质，是所有生命物质，是所有生命有机体的重要组成成分与维持生命所必需的结构有机体的重要组成成分与维持生命所必需的结构材料。材料。 按结

15、构不同分为：按结构不同分为：淀粉、纤维素淀粉、纤维素、糖原、氨基糖、糖原、氨基糖、壳多糖等多种壳多糖等多种OOOOOOO纤维素纤维素n世界上最丰富的天然有机物，占植物界碳含量的世界上最丰富的天然有机物，占植物界碳含量的50以以上，是植物细胞壁的主要成分。上，是植物细胞壁的主要成分。nD-葡萄糖葡萄糖以以-1,4糖苷键糖苷键组成的大分子多糖，分子量约组成的大分子多糖，分子量约500002500000，相当于，相当于30015000个葡萄糖基。个葡萄糖基。造纸的重要原料造纸的重要原料OHOH2COHOOHOOHOH2CHOOHOOHOOHOOCH2OHOHOOHOH2COCH2OHHOOHO16支

16、链淀粉支链淀粉淀淀 粉粉n植物体中贮存的养分，存在于种子和块茎中植物体中贮存的养分，存在于种子和块茎中n淀粉是淀粉是葡萄糖葡萄糖的高聚体，水解到二糖阶段为的高聚体，水解到二糖阶段为麦芽糖麦芽糖，完全水解后得到葡萄糖。完全水解后得到葡萄糖。n淀粉有直链淀粉和支链淀粉两类。直链淀粉含几百个葡萄淀粉有直链淀粉和支链淀粉两类。直链淀粉含几百个葡萄糖单元，支链淀粉含几千个葡萄糖单元。糖单元，支链淀粉含几千个葡萄糖单元。多糖的生物活性l抗肿瘤活性：抗肿瘤活性：香菇多糖、黄芪多糖、芦荟多糖、香菇多糖、黄芪多糖、芦荟多糖、紫草多糖、人参多糖、南瓜多糖紫草多糖、人参多糖、南瓜多糖l增强免疫作用：增强免疫作用：香

17、菇多糖、银耳多糖、黑木耳多香菇多糖、银耳多糖、黑木耳多糖、茶多糖糖、茶多糖l降血糖、血脂：降血糖、血脂：茶多糖、香菇多糖、黑木耳多糖茶多糖、香菇多糖、黑木耳多糖l抗辐射、氧化：抗辐射、氧化：螺旋藻水溶性多糖、银耳孢子多螺旋藻水溶性多糖、银耳孢子多糖、枸杞多糖、螺旋藻多糖、褐藻多糖、海藻硫酸糖、枸杞多糖、螺旋藻多糖、褐藻多糖、海藻硫酸多糖、猴头菌丝多糖、红藻多糖、南沙参多糖多糖、猴头菌丝多糖、红藻多糖、南沙参多糖多 糖u概述概述u理化性质理化性质u提取与分离提取与分离u结构鉴定结构鉴定u海洋中的多糖海洋中的多糖 多糖的理化性质 1. 无还原性和变旋现象；也无甜味。无还原性和变旋现象；也无甜味。

18、2. 多糖通常为无定型粉末，一般具有很强的吸湿性。多糖通常为无定型粉末，一般具有很强的吸湿性。 3. 多糖一般多糖一般不溶于有机溶剂不溶于有机溶剂，尤其是低极性的有机溶，尤其是低极性的有机溶剂。剂。 4. 多糖一般微溶于冷水，多糖一般微溶于冷水，易溶于热水中或稀碱水溶液易溶于热水中或稀碱水溶液中。中。 5. 多糖有一定的多糖有一定的酸性酸性，尤其是有糖酸构成的多糖酸性，尤其是有糖酸构成的多糖酸性较强。较强。多 糖u概述概述u理化性质理化性质u提取与分离提取与分离u结构鉴定结构鉴定u海洋中的多糖海洋中的多糖 多糖的提取u热水提取法热水提取法：破坏最小破坏最小 甘薯去皮甘薯去皮 切成小块切成小块(

19、0.30.30.3cm3) 每组每组15g (4组共组共60g) 于搅拌器中于搅拌器中 加蒸馏水加蒸馏水240 mL 捣碎捣碎1min 分成分成4份份 3层纱布过滤层纱布过滤 滤液置滤液置50恒温水浴恒温水浴30min 倾去上层液体倾去上层液体 25 mL蒸馏水重新悬浮白色沉淀，室温下静置蒸馏水重新悬浮白色沉淀，室温下静置15min（两次）（两次） 60烘干烘干4h 称重称重用沸水提取用沸水提取2-6小时。提取液如粘度不大，则可采用小时。提取液如粘度不大，则可采用过过滤法滤法过滤去残渣，对于粘度大的提取液则必须采用过滤去残渣，对于粘度大的提取液则必须采用离离心法心法去残渣，即得到多糖提取液或上

20、清液。去残渣，即得到多糖提取液或上清液。例如：例如：大麦中活性多糖提取、大枣多糖提取、老头草大麦中活性多糖提取、大枣多糖提取、老头草中多糖的含量测定、乌龙茶多糖提取等。中多糖的含量测定、乌龙茶多糖提取等。提提取取淀淀粉粉u稀碱水溶液提取法：稀碱水溶液提取法： 酸性多糖或分子量较大的多糖在热水中溶解度不大，酸性多糖或分子量较大的多糖在热水中溶解度不大，所以常用所以常用5-15% NaOH或或Na2CO3水溶液提取水溶液提取*注意：注意：用稀碱溶液提取时，用稀碱溶液提取时，温度必须保持在温度必须保持在10以下以下，否则多糖容易发生降解反应。通常在冷却的条件下否则多糖容易发生降解反应。通常在冷却的条

21、件下(4)，放置放置6-8小时，然后过滤或离心，滤液用稀盐酸调节小时，然后过滤或离心，滤液用稀盐酸调节pH至中性即得碱性多糖提取液。至中性即得碱性多糖提取液。或用稀酸水溶液提取或用稀酸水溶液提取稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀缩与醇析而获得多糖沉淀u酶解法：酶解法： 在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取取 粉碎的植物悬浮于水中粉碎的植物悬浮于水中, 调节至调节至最适温度最适温度（通常是（通常是38-50）, 最适最适pH范围范围（通常是（通常是pH3.8-4.

22、5）, 加入加入5-25%复合复合酶酶，反应，反应4小时小时, 过滤去残渣过滤去残渣, 滤液即为多糖提取液滤液即为多糖提取液u其它方法：其它方法： 超声波提取超声波提取主要是利用超声波空化产生的极大压力造成被破碎物细主要是利用超声波空化产生的极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体破裂，而且整个破裂过程在瞬间完成；同时超声波胞壁及整个生物体破裂，而且整个破裂过程在瞬间完成；同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散及溶解，加速植物中的产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散及溶解，加速植物中的有效成分进入溶剂，使其进一步增大了有效成分的溶出。有效成分进入溶剂，使其进一步增大了有效成分的溶

23、出。 微波提取微波提取靠微波电子管发出的电磁波，感应生电，又转化成分子的靠微波电子管发出的电磁波，感应生电，又转化成分子的动能而发热，具有快速、高效、安全的特点；其次微波的频率很高，动能而发热，具有快速、高效、安全的特点；其次微波的频率很高，能透入物体的深度较深，对细胞的结构有较大作用能透入物体的深度较深，对细胞的结构有较大作用。 多糖的纯化 多糖提取液多糖提取液: :含有许多杂质，主要是无机盐、单糖、寡糖、含有许多杂质，主要是无机盐、单糖、寡糖、低分子量的非极性物质及高分子量的有机杂质（如蛋白质、低分子量的非极性物质及高分子量的有机杂质（如蛋白质、木质素）木质素）除杂质除杂质分离分离去除无机

24、盐和小分子物质去除无机盐和小分子物质除蛋白质除蛋白质脱色脱色多糖的纯化多糖的纯化使用使用透析袋透析袋除去除去无机盐、单糖、无机盐、单糖、寡糖和低分子量寡糖和低分子量的非极性物质的非极性物质蛋白质除去通常采用方法：蛋白质除去通常采用方法：1. 酶法酶法：蛋白酶将提取液中的蛋白质酶解。常用链霉蛋白酶：蛋白酶将提取液中的蛋白质酶解。常用链霉蛋白酶(pronase)，其方法是在，其方法是在pH7-8时，加入链霉蛋白酶，时，加入链霉蛋白酶，37消化消化2-4天，然后反应物于沸水中加热天，然后反应物于沸水中加热5分钟以阻断反应。分钟以阻断反应。2. Sevage法法：蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性：蛋白质在

25、氯仿等有机溶剂中变性 将氯仿按多糖水溶液将氯仿按多糖水溶液1/5体积加入体积加入加入氯仿体积加入氯仿体积1/5的的正丁醇正丁醇剧烈振摇剧烈振摇20分钟分钟离心，分去水层与溶剂层离心，分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白交界处的变性蛋白 特点：特点：条件温和，缺点是效率不高，一般要重复条件温和，缺点是效率不高，一般要重复5次左右次左右 3. 三氟三氯乙烷法：三氟三氯乙烷法：等体积的三氟三氯乙烷加入到提取液中，等体积的三氟三氯乙烷加入到提取液中，在冷却的情况下搅拌在冷却的情况下搅拌10分钟，蛋白质成胶冻状，离心除去分钟，蛋白质成胶冻状，离心除去胶状蛋白质。上层水相再用上述溶剂处理胶状蛋白质。上层水相再

26、用上述溶剂处理2次，即得无蛋次，即得无蛋白质的多糖白质的多糖 特点：特点：此法效率较高，但因溶剂沸点较低此法效率较高，但因溶剂沸点较低(b.p.56)，易，易挥发，且必须在低温条件下进行，不宜大量应用。挥发，且必须在低温条件下进行，不宜大量应用。4. 三氯醋酸法三氯醋酸法：在冰浴中搅拌的情况下缓缓于提取液中加入：在冰浴中搅拌的情况下缓缓于提取液中加入15-30% 三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊。在低温下三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊。在低温下（4）放置）放置4小时。离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖提小时。离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖提取液取液 特点：特点：由于三氯醋酸的酸性较强，往往会引起某些

27、多糖的由于三氯醋酸的酸性较强，往往会引起某些多糖的降解，所以操作必须在低温下进行，该法效率较高，常用降解，所以操作必须在低温下进行，该法效率较高，常用于植物多糖的去蛋白于植物多糖的去蛋白多糖的脱色多糖的脱色 活性炭脱色法活性炭脱色法活性炭对多糖有较强的吸附作用，多活性炭对多糖有较强的吸附作用，多糖损失很大，一般不用糖损失很大，一般不用 弱碱性离子交换树脂弱碱性离子交换树脂去除多糖粗品中游离的色素。去除多糖粗品中游离的色素。 对酸性多糖的吸附力强，故不宜使用。对酸性多糖的吸附力强，故不宜使用。多糖提取液，常有较深的色泽（一般为酚类化合物的聚合物）多糖提取液，常有较深的色泽（一般为酚类化合物的聚合

28、物）过氧化氢脱色法（氧化脱色）过氧化氢脱色法（氧化脱色）1）将将0.3-0.8%粗多糖水溶液用浓氨水调粗多糖水溶液用浓氨水调PH至至8 2）50 加入过氧化氢（比例为加入过氧化氢（比例为10-30%ml/g） 3）在）在 50 下保持下保持2小时小时 4）醋酸调节至）醋酸调节至PH7.0，减压浓缩，减压浓缩 5）3倍量乙醇沉淀，即得脱色的多糖。倍量乙醇沉淀，即得脱色的多糖。 该法在多糖粗品的脱色中常用。但必须严格控制脱色条件，该法在多糖粗品的脱色中常用。但必须严格控制脱色条件，如温度、时间、如温度、时间、PH等。尽管如此，该法也会引起一定多等。尽管如此，该法也会引起一定多糖的降解损失糖的降解损

29、失。多糖的分离多糖多糖: :不均一性不均一性，需要进行分级分离，需要进行分级分离先分析组分，根据组分的先分析组分，根据组分的摩尔比、特点、样品量摩尔比、特点、样品量选择合适的分级方法选择合适的分级方法v有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法v盐析法盐析法v金属络合法金属络合法v季胺盐沉淀法季胺盐沉淀法v层析法层析法有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法： 原理：根据不同的多糖在低级醇或酮（通常是乙醇或丙酮）原理：根据不同的多糖在低级醇或酮（通常是乙醇或丙酮）中具有不同溶解度而进行分离；分子量大的多糖较分子量中具有不同溶解度而进行分离；分子量大的多糖较分子量小的多糖在乙醇（或丙酮）中的溶解度小小的多糖在乙醇（或丙

30、酮）中的溶解度小 逐步加大乙醇（或丙酮）的浓度可将不同分子量的多糖分逐步加大乙醇（或丙酮）的浓度可将不同分子量的多糖分别沉淀出来别沉淀出来盐析法：盐析法： 原理：根据分子量不同的多糖在一定浓度的盐溶液中具原理：根据分子量不同的多糖在一定浓度的盐溶液中具有不同溶解度的性质分离各种多糖。有不同溶解度的性质分离各种多糖。 在多糖中加入中性盐如在多糖中加入中性盐如NaCl、KCl、(NH4)2SO4等至一定等至一定浓度，溶解度最小的多糖便沉淀析出浓度，溶解度最小的多糖便沉淀析出, ,然后上清液继续加然后上清液继续加盐至更高浓度，则另一多糖又沉淀析出。盐至更高浓度，则另一多糖又沉淀析出。金属络合法：金属

31、络合法： 原理：根据不同多糖能与各种铜、钡、钙和铅离子形成络原理：根据不同多糖能与各种铜、钡、钙和铅离子形成络合物而沉淀的性质进行多糖的纯化。合物而沉淀的性质进行多糖的纯化。 常用的络合剂有氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等常用的络合剂有氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等季胺盐沉淀法：季胺盐沉淀法： 原理：长链季胺盐能与酸性多糖形成络合物，在低离原理：长链季胺盐能与酸性多糖形成络合物，在低离 子强度的水溶液中不溶解的特性，使其沉淀析出子强度的水溶液中不溶解的特性，使其沉淀析出 增加溶液的离子强度到一定范围，络合物则逐渐离增加溶液的离子强度到一定范围，络合物则逐渐离 解，最终溶解。常用的季胺盐是十六烷基三甲基胺

32、溴解，最终溶解。常用的季胺盐是十六烷基三甲基胺溴 化物及其碱、十六烷基吡啶化物及其碱、十六烷基吡啶柱层析方法：柱层析方法：纤维素柱层析纤维素柱层析：不同浓度乙醇水溶液（如不同浓度乙醇水溶液（如80%、60%、40%、20%）洗脱）洗脱洗脱规律：洗脱规律：先洗脱的是分子量最小的多糖先洗脱的是分子量最小的多糖最终洗脱的是分子量最大的多糖最终洗脱的是分子量最大的多糖 阴离子交换柱层析阴离子交换柱层析利用多糖具有一定的酸性进行分离。利用多糖具有一定的酸性进行分离。使用最多的方法，效果好，操作简单使用最多的方法，效果好，操作简单凝胶柱层析：凝胶柱层析： 根据多糖分子的大小和形状的不同即按分子筛的原理进行

33、根据多糖分子的大小和形状的不同即按分子筛的原理进行分离的分离的 常用的凝胶有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶，展开剂为各种浓常用的凝胶有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶，展开剂为各种浓 度的盐溶液及缓冲液。度的盐溶液及缓冲液。亲和色谱亲和色谱用凝集素一般是蛋白质和糖蛋白作亲和色谱来分离多糖。用凝集素一般是蛋白质和糖蛋白作亲和色谱来分离多糖。多 糖u概述概述u理化性质理化性质u提取与分离提取与分离u结构鉴定结构鉴定u海洋中的多糖海洋中的多糖 多糖结构鉴定u纯度测定纯度测定u分子量的确定分子量的确定u糖种类以及比例的确定糖种类以及比例的确定u糖连接方式确定糖连接方式确定u糖构型的确定糖构型的确定纯度测定l超离心法：超

34、离心法：超速离心机（带照相设备）超速离心机（带照相设备） 多糖在离心场作用下形成单一区带多糖在离心场作用下形成单一区带l高压电泳法高压电泳法: :电泳后呈单一色斑或单一峰电泳后呈单一色斑或单一峰l凝胶柱层析：凝胶柱层析：分步收集中出现形状对称的单一峰分步收集中出现形状对称的单一峰l旋光测定法：旋光测定法：比旋光度相同比旋光度相同l高压液相色谱法高压液相色谱法须经过两种以上的方法进行确定须经过两种以上的方法进行确定 【原理】【原理】凝胶层析也称分子筛层析、排凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离凝胶的分子筛作用，根据被分离物

35、质的分子大小不同物质的分子大小不同来进行分离来进行分离的技术。的技术。分子量的确定凝胶柱层析凝胶柱层析 相对分子质量较大相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排被完全排阻阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以较短，移动速度快；所以首先流出首先流出。 相对分子质量较小相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全完全渗透渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以较长，移动

36、速率慢；所以最后流出最后流出。 中等大小的分子中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外，它们在凝胶颗粒内外部分渗透部分渗透，渗透的，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。顺序依次流出，从而达到了分离的目的。【基本概念基本概念】外水体积、内水体积、柱床体积外水体积、内水体积、柱床体积 、洗脱体积、洗

37、脱体积 外水体积（外水体积（Vo）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积内水体积（内水体积（Vi）是指凝胶颗粒中孔穴的体积）是指凝胶颗粒中孔穴的体积柱床体积柱床体积 （Vt）是指凝胶柱所能容纳的总体积。）是指凝胶柱所能容纳的总体积。Vs为固定相体积为固定相体积【基本概念基本概念】 洗脱体积洗脱体积（V Ve e）是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现液的体积。它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。时所流出的体积。 V Ve e一般是介于一般是介于V Vo o

38、 和和之间的。之间的。 对于对于完全排阻完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内，的大分子由于其不进入凝胶颗粒内， 故其故其洗脱体积洗脱体积 V Ve e V Vo o 对于对于完全渗透完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积内，故其洗脱体积 V Ve e 分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。之间。 洗脱体积的测定洗脱体积的测定 外水体积（外水体积（Vo）：可以通过测定）：可以通过测定完全排阻完全排阻的大分子物质的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用的洗脱体积来测定，

39、一般常用蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖-2000作为测定作为测定外水体积的物质。外水体积的物质。 内水体积（内水体积（Vi）：可以通过测定）：可以通过测定完全渗透完全渗透的小分子溶质的小分子溶质（如（如重铬酸钾重铬酸钾）的洗脱体积来测定）的洗脱体积来测定 柱床体积（柱床体积（Vt）：）： 1)可用下式计算：可用下式计算： Vt（D/2）2h 2）根据）根据 VtVoVi 可以得到可以得到 3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积体积。 对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个组分的组分的

40、Ve/Vo与其分子质量的对数成线性关系：与其分子质量的对数成线性关系： Ve/Vo b lgMr + c 通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定以相同条件进行洗脱，分别测定Ve ，并根据上述的线性并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后关系绘出标准曲线，然后Ve ，通过标准曲线即可求出其分子质量。通过标准曲线即可求出其分子质量。糖种类以及比例的确定1. 完全酸水解完全酸水解操作：在操作：在1M H2SO4中封管中封管100oC水解水解8小时，用碱中和。小时，用碱中和。水解的难易程度与组成多糖的单糖性质、单糖环的

41、形水解的难易程度与组成多糖的单糖性质、单糖环的形状和糖苷键的构型有关：状和糖苷键的构型有关：一般一般呋喃呋喃糖苷键较糖苷键较吡喃吡喃型型易水解，易水解， 型型较较型型易水解，含有易水解，含有糖醛酸糖醛酸或或氨基糖氨基糖的的大多不易水解大多不易水解HPLC法：法：流动相为流动相为乙腈乙腈-水水（85：15），流速），流速1.0mL/min，示差检测。示差检测。气相色谱法：气相色谱法： 将水解样品进行将水解样品进行NaBH4还原和还原和乙酰乙酰化制成糖醇乙酸酯衍生化制成糖醇乙酸酯衍生物。物。 或将水解样品进行或将水解样品进行硅醚化硅醚化，而后再进行分析。，而后再进行分析。薄层法薄层法 纸层析法：展

42、开剂大多为含水的溶剂系统，如纸层析法：展开剂大多为含水的溶剂系统，如正丁醇正丁醇-醋酸醋酸-水水(4:1:5)，EtOAc-吡啶吡啶-水水(2:1:2)等。等。 硅胶薄层法：常用的展开剂为硅胶薄层法：常用的展开剂为正丁醇正丁醇-丙酮丙酮-水水、正丁醇正丁醇-醋醋酸酸-水水或或正丁醇正丁醇-吡啶吡啶-水水。2. 糖的分析（包括种类和比例分析）糖的分析（包括种类和比例分析）糖连接方式的确定Haworth法：法：试剂：试剂：硫酸二甲酯和氢氧化钠硫酸二甲酯和氢氧化钠(或碳酸钠、碳酸钾或碳酸钠、碳酸钾)缺点：甲基化能力较弱，欲进行全甲基化反应，必须进缺点：甲基化能力较弱，欲进行全甲基化反应，必须进 行多

43、次反应。行多次反应。甲基化：将多糖中的游离羟基全部甲基化，进而水解后甲基化：将多糖中的游离羟基全部甲基化，进而水解后得到的化合物，其羟基所在的位置即为原来单糖残基的得到的化合物，其羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接点。根据不同甲基化单糖的比例，可以推测这种连连接点。根据不同甲基化单糖的比例，可以推测这种连接键型在多糖重复结构中的比例接键型在多糖重复结构中的比例甲基化方法甲基化方法Purdie法：法：试剂：试剂：碘甲烷和氧化银碘甲烷和氧化银为试剂为试剂(一般可在丙酮或四氢呋喃中进一般可在丙酮或四氢呋喃中进行行)缺点：氧化银有氧化作用，不能用于还原糖的甲基化。缺点：氧化银有氧化作用，不能用于还原

44、糖的甲基化。改良的方法：改良的方法：碘甲烷和四甲基脲碘甲烷和四甲基脲 Hakomori法：法：试剂：试剂：碘甲烷、甲基亚磺酰甲基钠（碘甲烷、甲基亚磺酰甲基钠（SMSM), DMSO为溶剂为溶剂缺点：需重复数次缺点：需重复数次反应进行程度的判断：反应进行程度的判断：红外检测红外检测无羟基吸收，表明甲基化完全无羟基吸收，表明甲基化完全 甲基化甲基化水解水解检测检测高碘酸氧化、高碘酸氧化、smith降解降解OOOOHOHOHOOOOHCHOOHCOOOOHCH2OHHOH2CCH2OH(CH2OH)2CH2OHCH2OHCH2OHIO4-KBH4H+以以14位键合位键合赤藓醇赤藓醇OOHOOHOHO

45、HOH2COOOHOH2CCH2OHCH2OHCH2OHCH2OHCH2OH2IO4-OHCOOOOHC+HCOOHKBH4H+以以16位键合位键合糖苷键构型的确定（1） 利用酶水解进行测定利用酶水解进行测定 麦芽糖酶麦芽糖酶一般能水解的为一般能水解的为-苷键，能被苷键，能被苦杏仁苷酶苦杏仁苷酶水解的水解的大多为大多为-苷键。苷键。（2）利用波谱法测定）利用波谱法测定红外光谱法：红外光谱法：-苷键苷键 890 cm-1-苷键苷键 840 cm-1 核磁法核磁法u利用利用端基质子端基质子的偶合常数的偶合常数对于葡萄糖对于葡萄糖 -苷键苷键 J7Hz, -苷苷键键 J3Hzu利用利用-苷键和苷键和

46、-苷键的苷键的端基碳端基碳的化学位移差别的化学位移差别u 利用利用2D NMR谱谱胡萝卜苷胡萝卜苷多 糖u概述概述u理化性质理化性质u提取与分离提取与分离u结构鉴定结构鉴定u海洋中的多糖海洋中的多糖 海洋动物多糖海洋动物多糖海藻多糖海藻多糖粘多糖：氨基多糖粘多糖：氨基多糖海藻多糖褐藻多糖褐藻多糖褐藻胶：褐藻胶：为甘露糖醛酸和古罗糖醛酸为甘露糖醛酸和古罗糖醛酸构成的线性多糖。构成的线性多糖。褐藻糖胶：褐藻糖胶：主要组成成分为硫酸化的主要组成成分为硫酸化的岩藻糖。岩藻糖。海带淀粉：海带淀粉：是一类葡聚糖，其生理功是一类葡聚糖，其生理功能类似于植物中的淀粉。能类似于植物中的淀粉。红藻多糖红藻多糖琼胶

47、、卡拉胶琼胶、卡拉胶绿藻多糖绿藻多糖微藻多糖微藻多糖琼胶和卡拉胶f两者均为细胞壁填充物，且均为两者均为细胞壁填充物，且均为半乳糖半乳糖f琼胶：琼胶：琼胶由琼胶由琼胶糖琼胶糖和和琼脂果胶琼脂果胶二部分组成，二部分组成， 琼胶糖琼胶糖是不含有硫酸酯盐的是不含有硫酸酯盐的非离子型多糖非离子型多糖，是形成凝胶的，是形成凝胶的组分；组分； 琼脂果胶琼脂果胶是非凝胶组分，是带有是非凝胶组分，是带有硫酸酯盐硫酸酯盐,葡萄糖醛酸和丙葡萄糖醛酸和丙酮酸醛酮酸醛的复杂多糖，也是在商业提取中力图去掉的部分。的复杂多糖，也是在商业提取中力图去掉的部分。 f卡拉胶：卡拉胶：在食品工业中主要用作胶凝、增稠、稳定和持水在食

48、品工业中主要用作胶凝、增稠、稳定和持水剂功能，在奶制品饮料中用作悬浮剂；在布丁、酸奶、掼剂功能，在奶制品饮料中用作悬浮剂；在布丁、酸奶、掼奶油、冰淇淋、奶酪中用作增稠稳定剂；在红肠、洋火腿奶油、冰淇淋、奶酪中用作增稠稳定剂；在红肠、洋火腿生产中用作持水剂生产中用作持水剂 ；果冻中用作胶凝剂；果冻中用作胶凝剂琼 胶 糖OOHOOHCH2OOCH2OHOHOOHOOHOCH2OOCH2OHOHOHOOHOCH2OOOCH2OHOHOHOA: () 酸水解酸水解AAE: () 酶水解酶水解E琼二糖琼二糖琼四糖琼四糖新琼二糖新琼二糖新琼四糖新琼四糖琼二糖琼二糖新琼二糖新琼二糖

49、蓝色标记：蓝色标记：3,6-内醚内醚-L-半乳糖半乳糖 绿色标记：绿色标记：D-半乳糖半乳糖壳多糖和壳聚糖 壳多糖，又名甲壳素、几丁质，广泛存在于虾、蟹和昆虫壳多糖，又名甲壳素、几丁质，广泛存在于虾、蟹和昆虫等节肢动物的外壳和菌、藻的细胞壁中，是自然界中最等节肢动物的外壳和菌、藻的细胞壁中，是自然界中最为丰富的生物高分子之一，尤以在海洋虾、蟹中的资源为丰富的生物高分子之一，尤以在海洋虾、蟹中的资源蕴藏量最大蕴藏量最大OHOH2CHOHONHCOCH3OOHOH2CHONHCOCH3OOHOH2CHONHCOCH3OHOH2COHONHCOCH3OHnN-乙酰基乙酰基-D-氨基葡萄糖通过氨基葡萄糖通过-1,4-苷键相连的直链氨基多糖苷键相连的直链氨基多糖不溶于