生化-研究生实验3 重组质粒DNA提取及双酶切鉴定ppt课件

1、2019级研究生级研究生分子生物学技术分子生物学技术银银 巍巍生物化学教研室生物化学教研室实验三实验目的实验目的掌握质粒提纯的原理和方法掌握质粒提纯的原理和方法; ;掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切酶会运用内切酶. . 预习：基因克隆示意图 载体DNA(限制性内切酶切开)目的基因宿主细胞重组体已转化的宿主细胞阳性克隆株繁殖表达基因克隆操作过程：基因克隆操作过程： 分分分离载体和目的基因分离载体和目的基因 切切限制酶切载体与目的基因限制酶切载体与目的基因接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组

2、体筛选重组体 基因载体gene vector）78一一.质粒质粒DNA的制备的制备1 关于质粒的概念关于质粒的概念a.什么是质粒什么是质粒plasmid）？）？b.质粒的本质是什么？质粒的本质是什么？c.质粒有哪些构型？质粒有哪些构型？c.质粒有哪些特点？质粒有哪些特点？d.质粒的用途有哪些？质粒的用途有哪些？9(1)(1)质粒的定义质粒的定义 质粒是存在于细菌体内、独立于染色质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复制的一类双链环状体的、可以自主复制的一类双链环状DNADNA，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋(supercoil)(supercoil)形

3、式存在。形式存在。 10 超螺旋超螺旋DNA(SC DNA)DNA(SC DNA)(2)(2)质粒的三种构型质粒的三种构型11 开环DNA(open circular DNA,OC DNA) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。12 线状线状DNA(linear DNA,L DNA):DNA(linear DNA,L DNA): 如果两条链均断开，即为线状如果两条链均断开，即为线状DNADNA。电泳时，三者泳动速度大小关系（？）电泳时，三者泳动速度大小关系（？） 13(3)(3)质粒质粒DNADNA的一般特性：的一般特性： 质粒是细菌内的共生

4、型遗传因子质粒是细菌内的共生型遗传因子, ,有相对有相对独立性。独立性。 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。一些表型。 它是双链闭合环状它是双链闭合环状DNADNA，分子量大小不等。，分子量大小不等。14(4)(4)提取质粒提取质粒DNADNA的目的与意义（？）的目的与意义（？） 基因载体基因载体/ /基因克隆基因克隆/ /基因工程基因工程2 提取质粒DNA的常规方法:2.1 核酸分离纯化的总原则： 保证核酸一级结构完整 排除其他分子的污染蛋白质、脂类、 糖、有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）3.2 3.2 分离纯化质粒分离纯化质粒DNA D

5、NA 的主要步骤的主要步骤培养细菌使质粒扩增培养细菌使质粒扩增DNA的扩增与选择）的扩增与选择）细菌的收集与裂解细菌的收集与裂解 搜集搜集高速离心的方法高速离心的方法质粒质粒DNA的纯化的纯化 所有纯化方法都是利用了质粒所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环相对较小及共价闭合环状的性质。状的性质。3. SDS-3. SDS-碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA3.1 3.1 实验原理：实验原理：在有在有EDTAEDTA及去污剂及去污剂SDSSDS存在的条件存在的条件下，用碱处理细菌，可以使细菌的细胞下，用碱处理细菌，可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物染色体壁破裂，释

6、放出细胞内容物染色体DNADNA、质粒质粒DNADNA、蛋白质和、蛋白质和RNARNA等）；处理过程等）；处理过程中，染色体中，染色体DNADNA断裂成不同长度的双链断裂成不同长度的双链DNADNA。17强碱环境pH12.0-12.6时：宿主菌的线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离；当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒DNA又恢复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除去。18如果要提高DNA的纯度，则可以用R

7、NA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质。19溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTA、TrisCl组成组成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的减少抽提过程中的 机械机械 剪切作用剪切作用,防止破坏质粒防止破坏质粒.(保护作用保护作用) EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止防止DNA酶对酶对质粒分子的降解作用。（保护作用）质粒分子的降解作用。（保护作用） TrisCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围缓冲作用范围缓冲作用）20 溶液溶液II：由：由SDS十二烷基硫酸钠与十二烷

8、基硫酸钠与NaOH组成组成 SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性裂解细胞和蛋白质变性作用）变性裂解细胞和蛋白质变性作用） NaOHPH12的作用是破坏氢键，使的作用是破坏氢键，使DNA分子变性分子变性DNA变性作用）变性作用） 21溶液溶液IIIIII：HACHAC和和KACKAC组成的高盐溶液组成的高盐溶液( (复性作用复性作用) )HACHAC溶液能中和溶液溶液能中和溶液的碱性，使染色体的碱性，使染色体DNA DNA 变性而发生缠绕并使质粒变性而发生缠绕并使质粒DNADNA复性。复性。KACKAC会与会与SDSSDS溶解度很低的盐，并

9、与蛋白质形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的沉淀而除去；溶液中的DNADNA也会与蛋白质也会与蛋白质-SDS-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNADNA分离。分离。 实实验验步步骤骤及及注注意意事事项项加加1.5ml培养物于培养物于EP管，管，12000rpm30S 除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的100 l溶液溶液I，颠倒，颠倒EP管，混匀管，混匀 加入加入200l溶液溶液II，温和混匀，冰浴，温和混匀，冰浴35min 加入加入150l冰溶液冰溶液III，温和混匀，冰浴，温和混匀，冰浴35min，12000rpm5min 转移

10、上清到新转移上清到新EP管，加入等体积酚，管，加入等体积酚，12000rpm5min 转移上清到新转移上清到新EP管，加入等体积氯仿管，加入等体积氯仿/异戊醇，异戊醇，12000rpm5min 上层水相转移到新上层水相转移到新EP管，加入管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀，倍体积无水乙醇，颠倒混匀，-20 冰箱中放置冰箱中放置20min，120005min 弃上清，沉淀中加弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，乙醇，12000rpm5min 去上清，管平放室温静置去上清，管平放室温静置1015min ， 20 l TE 溶解溶解DNA 本卷须知：本卷须知： 1、加样枪正确使用；、加样枪正确使用；

11、 2、标记自己所提取的质粒类型、标记自己所提取的质粒类型pUC119-U6 ）；）； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中；、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头；、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干；、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀；、转移上清时不要吸到沉淀； 7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到要沾到 皮肤。皮肤。二、限制性内切酶切割重组质粒二、限制性内切酶切割重组质粒 1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease） 能在特异位点酶切位点上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制

12、性DNA片段。 主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。25作用作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源限制外源DNA， 保护自身保护自身DNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d

13、 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)(palindrome)切口切口 ：平端切口、粘端切口：平端切口、粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口pUC18/19酶切位点的分布示意图2 BamHI 、Hind酶切重组质粒及鉴定酶切重组质粒及鉴定1 实验原理： 利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列，并切割DNA,

14、产生一定长度的DNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因重组质粒DNA）32重组质粒重组质粒BamHIHind III双酶切双酶切电泳检测电泳检测5-G A A T T C-33-C T T A A G-5BamHI5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III2 实验材料: 重组质粒; BamHI 、Hind 限制性内切酶;反应缓冲液;琼脂糖凝胶电泳所需试剂和设备。343 实验步骤:A 建立反应体系B 酶切反应温育1-3h）C 电泳鉴定354、双酶切体系： 质粒DNA 10l 10M buffer 2l BamH 1l Hind 1l ddH2O 6l 36合