抗Xa与抗IIa活性检测方法标准操作规程

1、一、USP方法抗IIa活性（20.035.0IU/mg）.1仪器：紫外可见分光光度计、低温循环槽、电子天平.2试液：醋酸溶液：取冰乙酸42ml于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。pH7.4聚乙二醇6000缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷6.08g和氯化钠8.77g于1000ml容量瓶中，加水500ml溶解后，加聚乙二醇6000 1.0g，用盐酸调节pH至7.4，加水稀释至刻度。pH7.4缓冲溶液：称取三羟甲基氨基甲烷6.08g和氯化钠8.77g于1000ml容量瓶中，加水500ml溶解后，用盐酸调节pH至7.4，加水稀释至刻度。pH 8.4缓冲溶液：称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、氯化钠5

2、.12g和乙二胺四乙酸二钠1.40g于500ml容量瓶中，加水250ml溶解后，用盐酸调节pH至8.4，加水稀释至刻度。抗凝血酶III溶液：取1支抗凝血酶III，加水溶解成5Units/ml。用pH7.4聚乙二醇6000缓冲液稀释成0.5Unit/ml。人凝血酶溶液：用水将人凝血酶复溶，用pH7.4聚乙二醇6000缓冲液稀释成5Units/ml。显色底物：选择适合凝血酶的阿米酚试验的显色底物，用水稀释成浓度约3mmol/L。临用前用pH 8.4缓冲溶液稀释至0.5 mmol/L。标准溶液：用pH 7.4缓冲溶液将USP依诺肝素钠活性标准品稀释为浓度0.0150.070USPIU/ml之间的四个

3、浓度梯度。样品溶液：用pH 7.4缓冲溶液将依诺肝素钠样品稀释为与标准溶液浓度一致的浓度梯度。.3检测过程：取18支检测管，B1、B2为空白；T1、T2、T3、T4为样品溶液，各双份平行；S1、S2、S3、S4为标准溶液，各双份平行。按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的顺序，每管中加入抗凝血酶III的体积为V（2050l），和同样体积的pH 7.4缓冲溶液（空白）、标准溶液或样品溶液；混合，但不要产生气泡。于37温浴1分钟。向每管中加入2V人凝血酶溶液（40100l），温浴1分钟。再加入5V显色底物（100250l），4

4、分钟后加入5V的醋酸溶液（100250l）终止反应。以B1为空白，用紫外可见分光光度计在405nm处测量光吸收。空白B2的吸收值相比B1不得超过0.05。.4计算对每个浓度系列，将光吸收回归，与样品溶液和标准溶液的浓度对数值作线性分析。然后以量平行线分析统计方法计算每mL中依诺肝素钠抗IIa因子IU活性。4个浓度溶液的计算值组合计算得到最终的平均值，然后计算可信限度。抗IIa因子用IU/mg表示，按干品计。两人结果的相对平均偏差不得超过5.0%。抗Xa因子活性（90125IU/mg）.1仪器：紫外可见分光光度计、低温循环槽、电子天平.2试液：醋酸溶液、pH7.4聚乙二醇6000缓冲液、pH7.

5、4缓冲溶液、pH 8.4缓冲溶液同抗IIa因子检测。抗凝血酶III：取1支抗凝血酶III，加水溶解成5Units/ml。用pH7.4聚乙二醇6000缓冲液稀释成1.0Unit/ml。Xa因子溶液：用pH7.4聚乙二醇6000缓冲液稀释，使之在下述检测中405nm处光吸收每分钟增加不超过0.20，但要用体积为V的 pH7.4的缓冲液代替依诺肝素钠溶液。显色底物：选择适合Xa因子的阿米酚试验的显色底物，用水稀释成浓度约3mmol/L。临用前用pH 8.4缓冲溶液稀释至0.5 mmol/L。标准溶液：用pH 7.4缓冲溶液将USP依诺肝素钠活性标准品稀释为浓度0.0760.180 USP IU/ml

6、之间的四个浓度梯度。样品溶液：用pH 7.4缓冲溶液将依诺肝素钠样品稀释为与标准溶液浓度一致的浓度梯度。.3检测过程：取18支检测管，B1、B2为空白；T1、T2、T3、T4为样品溶液，各双份平行；S1、S2、S3、S4为标准溶液，各双份平行。按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的顺序，每管中加入抗凝血酶III的体积为V（2050l），和同样体积的pH 7.4缓冲溶液、标准溶液或样品溶液；混合，但不要产生气泡。于37温浴1分钟。向每管中加入2VXa因子溶液（40100l），温浴1分钟。再加入5V显色底物（100250l），

7、4分钟后加入5V的醋酸溶液（100250l）终止反应。以B1为空白，用紫外可见分光光度计在405nm处测量光吸收。空白B2的吸收值相比B1不得超过0.05。.4计算对每个浓度系列，将光吸收的回归，与样品溶液和标准溶液的浓度对数值作线性分析。然后以量平行线分析统计方法计算每mL中依诺肝素钠抗Xa因子IU活性。4个浓度溶液的活性对数值组合计算得到最终的几何平均值，同时计算可信限度。抗Xa因子用IU/mg表示，按干品计。两人结果的相对平均偏差不得超过2.0%。二、EP方法 抗FXa因子和抗Fa因子活性检测：（2人检测）.1.溶液的配制.1.1缓冲液的制备.1.1.1三羟甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液(p

8、H 7.4)：溶解三羟甲基氨基甲烷6.08g和氯化钠8.77g于纯化水500ml中，加牛血清蛋白10g。用盐酸（取浓盐酸85 ml用蒸馏水稀释到1000 ml，以下所用盐酸无特殊要求外，指此浓度盐酸）调节pH至7.4，用纯化水稀释到1000 ml。.1.1.2 三羟甲基氨基甲烷-EDTA缓冲液(pH 8.4)： 溶解氯化钠5.12g和三羟甲基氨基甲烷3.03g和EDTA二钠1.4g于纯化水250ml中。用盐酸调节pH至8.4，用纯化水稀释到500 ml。.1.2显色底物的制备：.1.2.1显色底物R1(N-苄氧基羰基-D-精氨酰基-L-甘氨酰基-L-精氨酸-4-硝基苯胺的二氢氯化物)：显色底物

9、S-2765：用水溶解显色底物成3mmol/L的溶液。临用前用三羟甲基氨基甲烷-EDTA缓冲液(pH 8.4)稀释成0.5mmol/L的溶液。.1.2.2显色底物R2(D-苯基丙氨酰基-pipecolyl-L-精氨酸-4-硝基苯胺的二氢氯化物水溶液)：显色底物S-2238：用水溶解显色底物成3mmol/L的溶液。临用前用三羟甲基氨基甲烷-EDTA缓冲液(pH 8.4)稀释成0.5mmol/L的溶液。.1.3牛Xa因子参照液的制备：Xa因子溶液：取Xa因子1瓶，加pH7.4缓冲液10ml溶解并稀释。.1.4 Antithrombin(抗凝血酶)：用三羟甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液(pH 7.4)配

10、制成含5IU/ml的溶液，在28下保存。.1.5 Thrombin：用pH7.4缓冲液稀释至5IU/ml，28下保存。.1.6抗凝血酶 R1参照标准品的制备：用三羟甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液(pH 7.4)配制成含1IU/ml的溶液。.1.7抗凝血酶R2参照标准品的制备：用三羟甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液(pH 7.4)配制成含0.5IU/ml的溶液。.1.8 30%乙酸：量取冰乙酸30ml于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀即得。.2. 抗FXa因子活性检测：（抗FXa因子活性90IU/mg125IU/mg）.2.1反应原理w 低分子肝素（LMWH）+抗凝血酶（AT过量）低分子肝素抗凝血

11、酶的复合物（LMWH-AT）w 低分子肝素抗凝血酶复合物（LMWH-AT）+FXa (FXa过量) LMWHATFXa +FXa(剩余) w 显色底物R1（S-2765）肽（peptide）+PNAw PNA在405nm处有吸收特性。.2.2检测.2.2.1标准液的配制根据原标准液的抗Xa因子的浓度（104IU/安瓿），加超纯水1ml配成约含104IU/ml贮备液，使用之前用pH7.4的缓冲液稀释成最大浓度0.18IU/ml、剂间比为0.75的四个浓度的对照液，分别记为S1、S2、S3和S4。稀释方法：取104IU/ml标准液0.0962ml于25ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，得0.400

12、IU/ml标准液。0.400IU/ml0.180IU/ml0.180IU/mlIU/ml0.180IU/ml0.101IU/ml0.180IU/ml0.076IU/ml.2.2.2样品溶液的配制： 首先估测样品的抗FXa因子含量（IU/mg），根据估测样品的抗FXa因子含量将样品用用pH7.4的缓冲液稀释成与标准溶液相一致的四个浓度的检测液，分别记为T1、T2、T3和T4。稀释方法：将样品稀释为50IU/ml，取此溶液1.0ml于25ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，得2.00IU/ml样品液。2.00IU/ml0.180IU/ml0.180IU/mlIU/ml0.180IU/ml0.101I

13、U/ml0.180IU/ml0.076IU/ml.2.2.3准备18支试管，T1、T2、T3和T4表示为检测样品，S1、S2、S3 和S4表示参照品，A01、A02作为空白，按A01，S1，S2，S3，S4，T1，T2，T3，T4， T1、T2、T3，T4，S1，S2，S3，S4，A02的顺序每支管中加入抗凝血酶 R1参照品溶液50l，分别加入检测样品液或参照品液或三羟甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液(pH 7.4)（检测空白）50l，用相同方法检测空白开始时和结束时的吸收度，两次空白检测的吸光度相差不超过0.05。每一支加完后，混合但不能产生气泡。.2.2.4在370.2下保温1min，每支管加入

14、牛抗Xa R参照品液100l，保温1min，加入显色底物R1250l。在370.2准确保温4min，最后加入30%乙酸溶液375l。.2.2.5移取反应混合液至半微量比色皿在405nm处以30%的乙酸溶液为参比，用紫外可见分光光度计检测吸收度，A01与A02的吸光度不得有显著差异，应在1小时内检测。.2.2.6结果计算：使用中国药典生物检定统计程序BS2000软件计算得出样品的抗Xa因子含量。平均可信限率 FL %应小于 15%。.3抗Fa因子活性检测：.3.1检测抗Fa反应原理w 低分子肝素（LMWH）+抗凝血酶（AT过量）低分子肝素抗凝血酶的复合物（LMWH-AT）w 低分子肝素抗凝血酶复

15、合物（LMWH-AT）+Fa (Fa过量) LMWHATFa +Fa (剩余)w 显色底物R2（S-2238）肽（peptide）+PNAw PNA在405nm处有光吸收特性。.3.2检测.3.2.1标准液的配制根据原标准液的抗IIa因子的浓度（31IU/安瓶），加超纯水1ml配成约含31IU/ml贮备液，使用之前用pH 7.4的缓冲液稀释成0.070IU/ml、0.042IU/ml、0.025IU/ml 、0.015IU/ml四个浓度的对照液，分别记为S1、S2、S3和S4。稀释方法：取31IU/ml标准品溶液0.0962ml于25ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，得0.119IU/ml标准

16、液。0.119IU/ml0.070IU/ml0.070IU/ml0.042IU/ml0.070IU/ml0.025IU/ml 0.070IU/ml0.015IU/ml.3.2.2样品溶液的配制：首先估测样品的抗FIIa因子含量（IU/mg），根据估测样品的抗FIIa因子含量将样品用pH 7.4的缓冲液稀释成相应抗FIIa四个浓度的检测液，分别记为T1、T2、T3和T4。稀释方法：将样品溶液稀释为13.5IU/ml，取此溶液1.0ml于25ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，得0.54IU/ml样品液。0.54IU/ml0.07IU/ml0.070IU/ml0.042IU/ml 0.070IU/m

17、l0.025IU/ml 0.070IU/ml0.015IU/ml .3.2.3准备18支试管，T1、T2、T3和T4表示为检测样品，S1、S2、S3 和S4表示参照品，A01、A02作为空白，按A01，S1，S2，S3，S4，T1，T2，T3，T4， T1、T2、T3，T4，S1，S2，S3，S4，A02的顺序，每支管中加入抗凝血酶R2参照品溶液50l，分别加入检测样品液或参照品液或三羟甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液(pH 7.4)（检测空白）50l，用相同方法检测空白开始时和结束时的吸收度，两次空白检测的吸光度相差不超过0.05。每一支加完后，混合但不能产生气泡。.3.2.4在370.2下保温1min，每支管加入人凝血酶 R参照品液10