菌种保藏及活化

1、菌种保藏及活化菌种保藏及活化 菌种保藏的原理和方法菌种保藏的原理和方法一、菌种保藏的目的一、菌种保藏的目的 保存、不退化 二、菌种保藏的原理二、菌种保藏的原理 DNA复制时自发突变是造成菌种退化的原因，因此要创造代复制时自发突变是造成菌种退化的原因，因此要创造代谢不活泼的状态谢不活泼的状态 。 休眠态（孢子、芽孢）休眠态（孢子、芽孢）代谢不活泼的状态代谢不活泼的状态 环境（干燥、低温、缺氧、缺营养）环境（干燥、低温、缺氧、缺营养） 斜面保藏法和穿刺保藏法斜面保藏法和穿刺保藏法 沙土管干燥保藏法沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法真空冷冻干燥保藏法液氮保藏法液氮保藏法 悬液保藏法悬液保藏法 低温

2、保藏法低温保藏法 三、菌种保藏的方法三、菌种保藏的方法 一种良好的菌种保藏方法，首先应保持原菌一种良好的菌种保藏方法，首先应保持原菌优良性状长期优良性状长期稳定稳定，同时还应该考虑方法的，同时还应该考虑方法的通用性通用性、操作的简便性操作的简便性和和设备设备的普及性的普及性。具体的方法很多，现把多种方法按类排列后作一。具体的方法很多，现把多种方法按类排列后作一综合性表解，以便读后有一全面了解。综合性表解，以便读后有一全面了解。（1）斜面保藏法：）斜面保藏法：是一种短期、过渡的保藏法，用新鲜斜面是一种短期、过渡的保藏法，用新鲜斜面接种接种后，后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在置最适

3、条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4冰箱保存（过低，会结冰；太高，达不到保存目的）。保存期一冰箱保存（过低，会结冰；太高，达不到保存目的）。保存期一般为般为36月。月。注意点：注意点：（1）水分：用牛皮纸避免水分蒸发，或用橡皮塞）水分：用牛皮纸避免水分蒸发，或用橡皮塞（2）培养基：专门设计的培养基，营养相对不太丰富）培养基：专门设计的培养基，营养相对不太丰富（3）微生物状态：孢子或芽孢长好后，再保藏，不易退化）微生物状态：孢子或芽孢长好后，再保藏，不易退化（4）温度：）温度：4冰箱保存（过低，会结冰；太高，达不到保存目冰箱保存（过低，会结冰；太高，达不到保存目的）的） （2）穿刺保藏法：）

4、穿刺保藏法： （略）（略） 1、斜面保藏法和穿刺保藏法、斜面保藏法和穿刺保藏法 2.沙土管干燥保藏法（略）沙土管干燥保藏法（略） 3.真空冷冻干燥保藏法真空冷冻干燥保藏法 是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低温度是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低温度下，（下，（-18），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。一般可保存都暂时停止，不易发生变异。一般可保存510年左右。年左右。 4.液氮保藏法

5、液氮保藏法 是适用范围最广的微生物保藏法，其保存期最长。因为液氮的温度是适用范围最广的微生物保藏法，其保存期最长。因为液氮的温度可达可达-196，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（-130），），故此时代谢活动已停止。保藏期一般为故此时代谢活动已停止。保藏期一般为23年，长的可达年，长的可达9年之久。年之久。 5.悬液保藏法（略）悬液保藏法（略） 6.低温保藏法低温保藏法 四、菌种保藏的共同注意点四、菌种保藏的共同注意点 1、严格的无菌操作；、严格的无菌操作； 2、用于保存的微生物在生长前必须处于、用于保存的微生物在生长前必须处于它生长良好的状态；它生长

6、良好的状态； 3、保藏过程中要防止退化的发生（不同、保藏过程中要防止退化的发生（不同的保藏方法，分别有不同的保存时间。）的保藏方法，分别有不同的保存时间。） 五、与菌种保藏相关的几个概念五、与菌种保藏相关的几个概念 1、活化：、活化：把微生物从保藏斜面转接到活化斜面上，把微生物从保藏斜面转接到活化斜面上，使其活性得以恢复。相对而言活化斜面培养基中的使其活性得以恢复。相对而言活化斜面培养基中的营养丰富些。营养丰富些。 保藏斜面保藏斜面 活化斜面活化斜面 2、复壮：、复壮：使微生物活性恢复的同时，恢复其优良使微生物活性恢复的同时，恢复其优良的生产性能。的生产性能。 保藏斜面保藏斜面 平板分离（自然

7、分离，剔除退化菌种）平板分离（自然分离，剔除退化菌种）活化斜面活化斜面六 实验步骤（一）实验所需物品： 1.仪器：霉菌培养箱、恒温摇床 2.玻璃器皿：50ml三角瓶、9cm培养皿。 3试剂：丙三醇（甘油）、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、氨苄青霉素、卡那霉素。 4.其他：移液枪、枪头、1.5ml离心管。（二）实验准备工作： 1、配制、配制LB培养基培养基（1L） 胰蛋白胨胰蛋白胨 10g 酵母提取物酵母提取物 5g 氯化钠氯化钠 10g 固体培养基需加入琼脂粉固体培养基需加入琼脂粉18g（夏季）或（夏季）或15g（冬季），高压灭菌，备用。（冬季），高压灭菌，备用。 2、将培养皿、锥形瓶、枪头、离

8、心管等高压、将培养皿、锥形瓶、枪头、离心管等高压灭菌。灭菌。 3、氨苄青霉素、卡那霉素过滤除菌分装放在、氨苄青霉素、卡那霉素过滤除菌分装放在1.5ml离心管内，离心管内，20保存。保存。 4、（三）操作步骤：1、菌株活化、菌株活化: 在无菌操作下在无菌操作下(1). 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3培养基为止（I 区）。(2). 旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。(3).重复步骤(2)的动作完成 III 区与 IV 区 (4). 灼烧接种环，将接种环归位。(5)将接种好的培养基置于指定温度指定温度的培养箱中培养。 图示:A、金属接种环B、平板划线法 2、菌种保存：在无菌操作下、菌种保存：在无菌操作下 (1)挑取活化所得的菌板上的单个菌斑培养，用3ml液体LB培养基（卡那或氨苄抗性）在7ml离心管内，37度摇床培养过夜。 (2)用移液枪吸取得到的一定浑浊度的菌液800微升和200微升丙三醇加入1.5ml离心管中，混匀。-80度保存。3.注意事项：(1).用移液枪时枪杆千万不要触碰器皿内壁，触