MALDI-TOF MS病原体鉴定质量保证专家共识

1、MALDIMALDITOFTOF MSMS 病原体鉴定质量保证病原体鉴定质量保证专家共识专家共识基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离 飞 行 时 间 质 谱 (matrix assisted laserdesorption ionization timeofflight mass spectrometry, MALDITOF MS)作为一种新兴的软电离质谱技术，由于其具有快速、准确、灵敏、自动化及高通量等检测特点，已成为一项革命性病原体快速鉴定技术被用于临床微生物实验室，并将逐步取代常规病原体生化鉴定方法。任何新兴技术应用于临床都需要建立规范的质量保证体系，以确保检测质量。本专家共识将对开展

2、 MALDITOF MS 用于病原体鉴定的设施与安全要求、人员培训与能力评估、MALDITOF MS 病原体鉴定过程的质量控制、检验程序性能验证等进行建议。设施与安全要求设施与安全要求1 1风险评估：风险评估：拟开展 MALDITOF MS 病原体检测的实验室需在风险评估基础上建立有效的安全防护策略，包括设备的使用、化学试剂的安全使用和处理丢弃、感染性病原体和被污染材料的处置等。风险评估包含确定工作流程和鉴定步骤中可能发生的化学和生物危害，以及降低风险的方法。2 2安全防护：安全防护：任何操作临床病原体样本或病原体的实验活动至少需要在二级生物安全实验室(BSL2)中进行。 MALDITOF M

3、S 应安置在二级生物安全实验室内，同时使用 MALDITOF MS 检测临床病原体样本时除了需考虑生物危害的风险外还要注意化学试剂的潜在风险。人员培训与能力评估人员培训与能力评估各实验室应具备 MALDITOF MS 检测过程中涉及的所有操作人员的初次培训和定期能力评估的程序文件，对涉及的所有操作人员应进行初次和定期(至少 6 个月一次)的培训以及能力评估，培训考核需遵循制造商的使用手册或实验室的标准操作规程，培训的内容包括原理方法、信息技术、仪器维护、结果报告与解释等方面。此外，还应采用一组形态和生化特征典型的菌株对培训者进行人员比对和/或考核，以确保所有操作者鉴定结果的一致性。通过培训，要

4、求每位操作人员对每种病原体的鉴定结果必须达到本实验室设定的每种病原体的最小结果阈值。保存所有培训、考核和能力评估记录。建议 1对于临床常见细菌(非高致病)， 操作人员的个人防护应按标准预防要求，其病原体分离培养、蛋白提取及靶板点样时应在生物安全柜内进行，点样后的靶板转移至 MALDITOF MS，分析过程中也需注意生物安全防护；对潜在的含生物危害二类及以上的高致病病原体如布鲁菌、炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌等的临床样本，实验室人员应请示医院感染管理部门并尽量避免培养检测，必要情况下需要在生物安全柜内采用经灭活程序灭活后再进行质谱分析。建议 2前期的样本处理过程中将会使用一些有机溶剂如乙醇、甲酸、乙腈

5、、三氟乙酸和基质液等，这些溶剂具有腐蚀性或可燃性，可引起人体皮肤黏膜腐蚀、呼吸及循环系统功能紊乱、多脏器损伤，因此在实验的过程中使用此类有机溶剂试剂时建议有一个良好的通风环境，同时需加强操作人员的呼吸道、皮肤黏膜尤其是眼面部的个人防护。MALDIMALDITOFTOF MSMS病原体鉴定过程的质量保证病原体鉴定过程的质量保证质量保证可确保 MALDITOF MS 病原体鉴定结果的准确性和及时性，其内容涵盖分析前、分析中和分析后。( (一一) )分析前分析前1 1菌株准备：菌株准备：所有菌株均采用新鲜培养(1648 h)的单个菌落，推荐细菌采用血琼脂平板培养，真菌采用沙保罗平板培养，冻存菌株传代

6、两次后使用。2 2靶板点样：靶板点样：先将质控菌株/蛋白标准品点在靶板相应孔位，再点待测菌落。点样时应注意菌量适当、厚度均匀，不可带有琼脂成分。3 3加基质液：加基质液：点样后加入基质液，应自然凉干。4 4特殊病原体：特殊病原体：如分枝杆菌、丝状真菌和诺卡菌等需要通过蛋白提取法进行提取前处理，包括使用甲酸、乙腈、破壁硅珠管等试剂耗材。详细处理过程建议参考制造商提供的 SOP 进行操作。5 5样本准备注意事项：样本准备注意事项：(1)靶板点样加入基质液后，需完全干燥形成结晶方可进行检测。(2)靶板准备完成后，如为细菌或酵母菌，需在 48 h 内完成检测；如为分枝杆菌，需在 4 h 内完成检测；如

7、曲霉菌等丝状真菌，需立刻完成检测。( (二二) )分析中分析中一般情况下，MALDITOF MS 检测可以得到以下几种鉴定结果：(1)高置信的鉴定结果；(2)多个鉴定结果，且每个结果的置信度相似；(3)无鉴定结果。1 1结果判断：结果判断：当 MALDITOF MS 提供了高置信的结果时，无需对图谱进行检查和复核；而当出现多个鉴定结果或无鉴定时，可能出现以下问题：(1)低质量的图谱导致无鉴定结果：需检查菌株和试剂耗材的质量、仪器性能状态以及具体操作环节；(2)图谱质量较好而不符合预期的鉴定、多个鉴定结果或者无鉴定结果：应检查样本是否分纯、是否污染或数据库不包含待检菌种。2 2结果阈值：结果阈值

8、：目前 MALDITOF MS 的结果阈值通常分为两种：一种以置信度为阈值，置信度90%的单一结果为优质鉴定结果，60%90%且具有多个鉴定结果为低分辨结果(需要补充实验进行分类)，2 分(9.5 分)的结果可以鉴定到种，1.7 至 2.0 分(9.09.5 分)之间可以鉴定到属(需要补充实验进行分类)，1.7 分(9.0 分)为不能鉴定或可能鉴定到属。( (三三) )分析后分析后1 1结果复核：结果复核：鉴定结果的复核是分析后质量管理的重要组成部分，是保证检验结果准确的一个重要环节。MALDITOF MS 鉴定结果为以下病原体时，需通过相应的补充实验进行进一步鉴别。2 2仪器维护及保养：仪器

9、维护及保养：按照制造商要求定期进行维护及保养。3 3化学试剂：化学试剂：必须使用仪器制造商要求纯度的化学试剂。质量控制质量控制( (一一) )室内质控室内质控建议 3需血清学试验确认的病原体：大肠埃希菌(疑似志贺菌属和大肠埃希菌 O157)、 沙门菌属等； 需要其他确认试验进行鉴定的病原体： 烟曲霉复合群、黄曲霉复合群、肺炎链球菌和缓症链球菌群等；需要测序鉴定或报告到群：蜡样芽孢杆菌复合群、洋葱伯克霍尔德菌复合群、鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌、无色杆菌属、弗劳地柠檬酸杆菌复合群和阴沟肠杆菌复合群等。实验室需按照 MALDITOF MS 制造商的推荐及相关管理指南制定质控程序。按照制造商

10、要求评估质量分析器、相关系统(软件和数据库)、化学试剂、靶板和用户的操作(靶板点样、有条件时萃取)。1 1质控菌株：质控菌株：质控阳性对照菌株种类应根据实验室拟开展的鉴定病原体范围进行选择，质控菌株可采用制造商建议的标准菌株或经实验室测序等方法确认的临床菌株。所有质控阳性对照菌株进行质控操作时需采用新鲜培养(1648h)的单个菌落，推荐细菌采用血琼脂平板培养，真菌采用沙保罗平板培养，冻存菌株传代两次后使用。2 2质控操作及频率：质控操作及频率：按照制造商的 SOP 文件要求，在靶板清洗、基质溶液及标准品溶液配制后需每次进行阴性及阳性对照的质量控制，每次病原体鉴定时亦应如此。3 3仪器校准：仪器

11、校准：检测前仪器需进行自身校准，校准通过后方可进行后续鉴定。4 4阳性对照：阳性对照：使用大肠埃希菌标准菌株(ATCC8739)鉴定分值必须达到制造商要求；如使用标准蛋白测试品， 在分子量大于 12 000 以上的区域必须出现校准峰，应明确检测到 m/z 13 683 和 16 952 两个峰，确保高分子量端的准确性。5 5阴性对照：阴性对照：检测结果应为No peak found或者无鉴定结果。阴性对照需使用空白试剂，用于排除可能由试剂污染或重复性靶板(阴性对照应为任意孔位)清洗不当造成的假阳性结果。当质控结果失控或校准未通过时，应从各环节分析原因并予以纠正。常见原因包括：质控菌株/蛋白标准

12、品污染、使用错误的质控菌株/蛋白标准品、使用错误的试剂、操作人员的操作失误等。记录分析失控原因并归档。如果未发现上述明显的原因可重复测定质控菌株/蛋白标准品，结果在控，可直接进行后续检测；若不能纠正，应联系制造商采取相应的措施。( (二二) )室间质评室间质评建议 4其他质控菌株(标准菌株或经验证的临床菌株)， 包括革兰阴性杆菌(建议采用产气肠杆菌)、革兰阳性球菌(建议采用粪肠球菌)和念珠菌(建议采用光滑念珠菌)。室间质评：全程参加由组织方提供的室间质评计划。当出现室间质评不符时，及时找到失控原因并纠正。保存每次室间质评信息，包括结果反馈、纠正措施等。无第三方组织的室间质评计划时，实验室应定期

13、自行组织与其他实验室同类检测方法的室间比对。检验程序性能验证检验程序性能验证MALDITOF MS 性能验证包括准确度和精密度。通过 MALDITOF MS 和现用方法或参考方法(如测序方法)获得的病原体鉴定结果进行比较以实现准确度验证。准确度验证尽可能包括临床菌株而不限于是质控菌株或标准菌株。精密度验证应包括所有主要可能存在的变量，如不同的培养基、培养条件和提取技术，通常用标准菌株或质控菌株进行精密度验证，应评估批内、批间，操作者之间以及连续几天的重复性或再现性。在适用的情况下，还应评估病原体 MALDITOF MS 与 LIS 或其他仪器系统之间接口的正常运行。( (一一) )适用范围适用

14、范围1实验室引入 SFDA 批准的 MALDITOF MS 检测系统时，使用前应进行全面验证。2实验室使用 MALDITOF MS 时，若对病原体种类、试剂、数据库、分析软件和硬件等进行更换或升级以及扩大检测范围(即在原有检测病原谱基础上增加新的病原体)后，应进行部分验证。建议 5性能验证符合要求后投入临床常规使用，在设备状态、环境、检测方法、 人员等维持稳定的情况下，可采用文件和数据审核等定期评审分析系统状态，无需每年实施性能验证。( (二二) )验证方案验证方案MALDITOF MS 验证所用菌株按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或经参考方法确认的临床菌株，选择的菌种应尽量覆盖 MALD

15、ITOF MS 制造商公布的可鉴定菌谱，包括革兰阳性及阴性球菌、革兰阳性及阴性杆菌、厌氧菌、酵母菌、苛养菌、分枝杆菌等，同时还应覆盖验证本地区、本实验室以往检出的特殊病原体种类。1 1全面验证：全面验证：准确度：常见病原体如革兰阳性及阴性球菌、革兰阳性及阴性杆菌、酵母菌每种类别至少验证 30 株，厌氧菌、苛养菌、分枝杆菌(如开展)、丝状真菌(如开展)每种至少 10 株，并覆盖本地区、本实验室检出的重要病原体。比较 MALDITOF MS 鉴定结果与实验室现用方法或参考方法(如测序方法)之间的符合率。精密度：选择 10 株代表性菌株，每天重复检测 3 次，连续 3 d。2 2部分验证：部分验证：

16、见表 1。表 1常见情况下验证方案( (三三) )可接受标准可接受标准严格按照制造商使用说明的要求进行结果判读(参考环节控制中的结果阈值)。适用范围适用范围举例举例推荐方案推荐方案扩大病原谱补充某一种病原体准确度： 选择 10 株以上该种类病原体，与现用方法或参考方法(如测序方法)比较精密度： 1 日内重复检测质控菌株 3次试剂种类改变商品化试剂改为自配试剂设备重大修理更换离子检测器或激光源按照上述方案进行检测性能和 LIS 数据传输验证1 1准确度要求：准确度要求：验证的标准/质控菌株符合率应为 100%，临床菌株的符合率应在 90%以上。2 2精密度要求：精密度要求：菌株鉴定结果符合率应为 100%。若未能满足上述验证要求，则 MALDITOF MS 不能通过验证。制造商和/或使用者须采取相应措施，修正后的检测系统应再次进行验证。以上专家共识内容仅限于 MALDITOF MS 用于临床病原体鉴定的质量保证要求，MALDITOF MS 作为蛋白质组学研究的支柱技术，在医学及生命科学领域有更多的应用前景和价值，其他相关领域的应用的质量保证