微生物实验报告

1、食品微生物学实验开放性实验项目报告书“校园湖水中细菌学检查”一实验流程图参考文献：1. 中华人民共和国国家标准.食品卫生微生物学检验，GB/T4789.32003:1318 2. 论大肠菌群检测方法（华中农业大学学士学位论文） 3. 水环境中大肠菌群的检测方法的研究 4. 中国环境检测水中大肠菌群的快速检测方法 5. 环境保护与循环经济水环境中大肠菌群的检测方法的研究 6. 环境工程微生物学第二版，周群英、高延耀篇著 高等教育出版社出版 7.环境工程微生物学, 王国惠 主编 化学工业出版社出版 2005.7 8污染控制微生物试验，马放、任南琪、杨基先 主编 哈尔滨工业大学出版社出版 2006.

2、1 9.环境微生物学，乐毅全、王士男 化学工业出版社 2005.310水质的细菌学检验 撖云轩二、实验目的 1. 学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法； 2. 掌握水样中大肠菌群测定的原理、意义和检测方法。 三、实验原理 1.细菌总数检测原理：水中的细菌总数越多，说明水中有机物的含量就越高，水体被污染的程度越重。水中细菌的种属繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中的细菌的总数实际上是一种近似值。肠道中的绝大多数腐生性和致病性的细菌，可在牛肉膏蛋白胨培养基上进行生长。因

3、此应用平板菌落计数技术来测定水样中的细菌总数基本上能代表水样中细菌的数量。 2.大肠菌群检测的原理：大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中的大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。MPN法是一种将样品多次管稀释至无菌的计数方法，将三个稀释梯度的待检验样品稀释液接种于九只或15只试管培养基中，每个稀释梯度样液接种3或5支，经过培养后查阅MPN检测表，就可以得到原来样品液中微生物的估计数量。 3.水和饮料的微生物指标评价标准：

4、按中华人民共和国国家标准GB173241998.纯净水的微生物卫生指标为菌落总数20cfu/1ml。大肠菌群3mpn/100ml。致病菌不得检出。霉菌.酵母菌不得检出。其中一项不合格者为不合格产品。四、实验步骤（一）材料的采集：校园湖水星月湖 取距湖水面10-15cm深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱4C中保存，但不能超过24h。（二）材料的预处理： 1乳糖蛋白胨培养基(供多管发酵法的复发酵用)(1) 成份：蛋白胨2.5g，牛肉膏0.75g，乳糖1.25g，Nacl 1.25g

5、，1.6%溴甲酚紫乙醇0.25ml，蒸馏水250ml.(2) PH=7.2-7.4(3) 制备：按配方分别称取上述成份加热溶于250ml蒸馏水，调整pH=7.2-7.4加入1.6%的溴甲酚乙醇溶液0.25ml。充分混匀后分装于试管内，每管10ml，另取一小倒管装满培养基倒放入试管内，塞好棉塞，包扎。置于高压灭菌锅内以0.7kg/cm2（115）灭菌20min,取出置于阴冷处备用。2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（供多管法发酵用）（1）成份：蛋白胨7.5g,牛肉膏2.25g,乳糖3.75g,Nacl3.75g,1.6%溴甲酚紫乙醇 溶液0.75ml,蒸馏水250ml。 （2）pH=7.2-7.4(3)

6、制备：按配方分别称取上述成份加热溶于250ml蒸馏水，调整pH=7.2-7.4加入1.6%的溴甲酚乙醇溶液0.75ml，充分混匀后分装于试管内，每管5ml。在每管中倒放入装满培养基的小导管。塞好棉塞，包扎，置于高压灭菌锅内以115灭菌20min，取出置于阴冷处备用。 3伊红美蓝培养基（1）成份：蛋白胨2.5g，乳糖2.5g,磷酸氢二钾0.5g,琼脂5g, 蒸馏水250ml., 2%伊红5ml,美蓝水溶液3.25ml。 （2）制备：先将琼脂加至200ml蒸馏水，加热溶解，后加入磷酸氢二钾及蛋白胨乳糖使之溶解,再调pH=7.2-7.4,再加入伊红,美蓝水溶液, 置于高压灭菌锅内以（115）灭菌20

7、min,储存于冷暗处备用。 4牛肉膏蛋白胨培养基制备(1) 蛋白胨1.5g，牛肉膏0.75g，Nacl 0.75g，琼脂3g, 蒸馏水250ml. （2）pH=7.6（3）制备：将上述成份依次倒入装有250ml蒸馏水的烧杯中溶解，待全部溶解后，加水补足因加热蒸发的水量，用10%NaOH调整pH为7.6。塞上棉塞，包扎好待灭菌。5.乳糖胆盐发酵管（单料）（1）成分蛋白胨 20g 、猪胆盐(或 牛、羊胆盐) 5g 、乳糖 10g 、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL、 蒸馏水 1 000mL、pH 7.4（2）制法将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中,校正pH,加入指示剂,分装每管10mL,并放入一个小倒

8、管,115高压灭菌15min。注:双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外,其他成分加倍。6、乳糖胆盐发酵管（单料，双料一起配制，按样品份数成比例配制，双料：单料=1：2）蛋白胨 40g 、猪胆盐(或 牛、羊胆盐) 10g 、乳糖 20g 、0.04%溴甲酚紫水溶液 12mL （酌情增减）、蒸馏水 1 000mL 、 pH 7.4（3）按样品份数*45=所需配制量，按上述比例换算配料称取量。（4）将试管排好，放入小倒管（管口朝下），1份样品需9支试管，其中3支配双料，6支配单料。（5）锅中放入比所需配制量略多的蒸馏水（考虑加温煮沸时蒸发）按1换算值称取配料、乳糖，放入锅中，静置10-15分钟，小火煮沸5-

9、10分钟，同时不断搅拌。（6）用40g/L的NaOH调节PH至7.4，加入溴甲酚紫水溶液，混匀。（7）配双料：每管加5ml,共加样品份数*3管。（8）配单料：在配双料后剩余的溶液中加等量的蒸馏水（配制量*2/3），每管加10ml,共加样品份数*6管（9）放入高压锅中灭菌。7EC肉汤胰蛋白(月示)或胰酪(月示)20.0g、3号胆盐或混合胆盐 1.5g、乳糖5.0g、磷酸氢二钾(K2HPO4) 4.0g、磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5g、氯化钠5.0g、蒸馏水1000.0mL将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm150mm试管(管内有倒立的小发酵管),每管8mL。121高压灭菌15min,最终

10、pH6.90.1。8生理盐水氯化钠8.5g、蒸馏水 1000.0mL 将氯化钠溶于蒸馏水中,121高压灭菌15min。9革兰氏染色液结晶紫染色液：结晶紫1.0g、95乙醇20.0Ml、1草铵水溶液 80.0mL将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。革兰氏碘液：碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300.0mL将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。沙黄复染液：沙黄0.25g、95乙醇 10.0mL、蒸馏水90.0mL将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。染色法a. 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1min,水洗。b.滴加革兰氏碘液,作用

11、1min,水洗。 c. 滴加95乙醇脱色约1530s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。d.滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。 结果：革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。10磷酸盐缓冲稀释液 贮存液磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g、蒸馏水500mL、1 mol/L氢氧化钠175 mL、将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中,用1 mol/L氢氧化钠约175 mL调至1 mol/L氢氧化钠约175 mL。用蒸馏水加至1000mL贮存于冰箱。（三）细菌总数的测定：1. 水样稀释：先取10ml灭菌的移液管取10ml原水样，并和4管9ml无菌水排列好，按原水样，10-1（2个），10-2（2

12、个）依次编号，再用1ml无菌移夜管吸取原水样于10-2标号的含9ml无菌水的试管中，摇匀即为10-2浓度菌液，同样方法用1无菌移液管吸取1浓度的无菌液于标号含9无菌水的试管中，摇匀即为10浓度菌液，其余10-1，10-2浓度，均按以上方法配制。2. 配置琼脂培养皿7个，包括原样水（2个），10-1（2个），10-2（2个），蒸馏水1个（对照用）。琼脂培养皿的制作采用倒平板法：取1支1mL无菌移液管分别取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内加热融化培养基，当培养基冷至45左右时，右手拿装有培养基的锥行瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指拖住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿掀开，到入培养基

13、后将培养皿平房在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混合，冷凝后即成平板，倒置于30培养2448h,观察结果。3. 初步发酵，将灭好菌的培养液从试管中取出，将水样注入试管中，向普通试管中注入原样水1ml（2个），10-1ml（2个），10-2ml（2个），蒸馏水1ml（1个），然后向小导管（7个）内注入普通培养基，分别倒置于以上试管中向三倍浓缩试管中注入10ml原样水（2个）。10ml蒸馏水（1个）对照。同样方法取3个小导管注入三倍浓缩培养液中，分别倒置于试管中，以上10支试管送至37摄氏度恒温箱内培养。4. 取出已经培养好的试管里的细菌，对试管进行观察，并记录结果发现：产酸

14、且产气的原样水+三倍浓缩（2个），产酸10-1（2个），10-2（1个），原样水（2个），表明为阳性。制备伊红美蓝培养基，取有变化的试管里的细菌进行接种、划线于伊红美蓝培养基上，进行培养。同时将琼脂培养皿取出，观察细菌菌落数并记数 5. 取出培养好的伊红美蓝培养皿，观察分别挑取不同培养皿内的细菌，对其进行染色，显微镜观察并判断其阴阳性，发现并取培养出的大肠杆菌接种于乳糖培养基及三倍乳糖培养基中进行复发酵。6. 观察复发酵结果（四）大肠菌群检测：1. 培养基和试剂 冰箱：04；恒温培养箱：361;恒温水浴锅：461；显微镜：10100； 均质器或灭菌乳钵；架盘药物天平：0g500g,精确至0.5

15、9；灭菌吸管1ml(具0.01L刻度)； 100ml（具0.1ml刻度）；灭菌锥形瓶：500mLo；灭菌玻璃珠：直径约5mm；灭菌培养皿：直径90mm；灭菌试管：16mm或160mm；灭菌刀、剪子、镊子等，乳糖胆盐发酵管;伊红美蓝琼脂平板；乳糖发酵管；EC肉汤；磷酸盐缓冲液；0.85%灭菌生理盐水；革兰氏染色液。2. 检样稀释 以无菌操作将检样25 (mL）放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好用灭菌均质器，以8 000rmin10 000r/min的速度处理1mi

16、n，做成l：10的均匀稀释液。 用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注人含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做l0倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管 3. 乳糖发酵试验 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种三管。乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发醉管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置36 士1 温箱内，培养24h士2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下