薄层色谱法分离鉴定叶绿素

1、1/12在线答疑：在线答疑：wy- wy- 大大学学通通用用化化学学实实验验技技术术薄层色谱法分离鉴定叶绿素薄层色谱法分离鉴定叶绿素实验实验122 122 薄层色谱法分离鉴定叶绿素薄层色谱法分离鉴定叶绿素122.1 122.1 实验目的实验目的 (1) (1) 掌握有机溶剂提取天然产物的原理和操作方法。掌握有机溶剂提取天然产物的原理和操作方法。 (2) (2) 掌握薄层色谱法分离原理和实验技术。掌握薄层色谱法分离原理和实验技术。2/12在线答疑：在线答疑：wy- wy- 大大学学通通用用化化学学实实验验技技术术薄层色谱法分离鉴定叶绿素薄层色谱法分离鉴定叶绿素122.2 122.2 实验原理实验

2、原理 植物叶片中的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，植物叶片中的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素主要包括叶绿素a a、叶绿素、叶绿素b b、-胡萝卜素及叶黄素等四胡萝卜素及叶黄素等四种。种。 叶绿体色素是脂溶性色素，植物叶绿体色素通常可用叶绿体色素是脂溶性色素，植物叶绿体色素通常可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。乙醇、丙酮等有机溶剂提取。在波长在波长662 nm662 nm、644 nm644 nm测定测定吸光值，可根据公式计算叶绿素吸光值，可根据公式计算叶绿素a a和叶绿素和叶绿素b b的含量。的含量。通过通过薄层色谱薄层色谱(TLC)(TLC)对叶绿体色素提取液进一步分离，

3、可分离对叶绿体色素提取液进一步分离，可分离叶绿素叶绿素a a、叶绿素、叶绿素b b、-胡萝卜素及去镁叶绿素，经多次胡萝卜素及去镁叶绿素，经多次制备可得少量叶绿素纯品，并进行光谱表征。制备可得少量叶绿素纯品，并进行光谱表征。3/12在线答疑：在线答疑：wy- wy- 大大学学通通用用化化学学实实验验技技术术薄层色谱法分离鉴定叶绿素薄层色谱法分离鉴定叶绿素122.3 122.3 实验步骤实验步骤1. 1. 大叶黄杨叶片预处理：大叶黄杨叶片预处理：2. 2. 叶绿体色素的提取：叶绿体色素的提取： 称取称取1 1 g g预处理过的大预处理过的大叶黄杨叶片叶黄杨叶片 边加入提取剂边加入提取剂 边快速边快

4、速研磨叶片研磨叶片 量取量取30 mL30 mL提取剂提取剂( (95%95%乙醇乙醇) )研磨约研磨约10 min 10 min 通风橱中通风橱中 用不锈钢网用不锈钢网滤去残渣滤去残渣 得到提取液得到提取液 剪细碎剪细碎 置于研钵置于研钵 采集新鲜成熟大叶采集新鲜成熟大叶黄杨叶若干黄杨叶若干 投入沸水中投入沸水中 不断搅拌不断搅拌30 s 30 s 凉水中冷却凉水中冷却 迅速捞起迅速捞起分批分批用滤纸吸干叶片表面水分用滤纸吸干叶片表面水分 清水洗净清水洗净4/12在线答疑：在线答疑：wy- wy- 大大学学通通用用化化学学实实验验技技术术薄层色谱法分离鉴定叶绿素薄层色谱法分离鉴定叶绿素(1)

5、(1)提取液的粗提纯：提取液的粗提纯：(2)(2)提取液的进一步提纯：提取液的进一步提纯：粗提纯的粗提纯的提取液提取液 离心管离心管 用保鲜膜用保鲜膜盖住管口盖住管口 1000 rad/min1000 rad/min转速转速离心离心10 min 10 min 取其上层清取其上层清液避光保存液避光保存较纯的色素较纯的色素提取液提取液转入转入25 25 mLmL容量瓶中容量瓶中用石油醚用石油醚定容定容测量其在测量其在662 nm662 nm、644 nm644 nm的吸光值的吸光值 0.5 cm 0.5 cm 比色皿比色皿 分液漏斗分液漏斗15 mL15 mL石油醚石油醚上步的提取液上步的提取液

6、静置静置30s 30s 5 mL5 mL饱和食盐水饱和食盐水15 mL15 mL蒸馏水蒸馏水 分层分层 分去分去 下部水层下部水层5 mL5 mL饱和食盐水饱和食盐水分去分去 下部水层下部水层转入棕色瓶转入棕色瓶中保存中保存 提取液提取液 得到得到15 mL15 mL蒸馏水蒸馏水5/12在线答疑：在线答疑：wy- wy- 大大学学通通用用化化学学实实验验技技术术薄层色谱法分离鉴定叶绿素薄层色谱法分离鉴定叶绿素 硅胶硅胶G G薄层薄层板活化板活化 硅胶硅胶G G薄薄层板层板100100120 120 烘箱烘箱 烘烘303060 min 60 min 干燥箱中干燥箱中保存保存 (2) (2) 点样

7、点样 取硅胶取硅胶G G薄层板薄层板 板一侧距底边板一侧距底边1.5 cm1.5 cm处画处画一条横线作为起点线一条横线作为起点线 起点线以上起点线以上12 cm12 cm处画一处画一条横线作为终点线条横线作为终点线 用干燥干净的用干燥干净的玻璃毛细管在玻璃毛细管在起点线处点样起点线处点样 晾干晾干 溶剂挥发后轻触溶剂挥发后轻触6 67 7次次 斑点直径尽量小斑点直径尽量小 3. 3. 叶绿体色素的分离叶绿体色素的分离: : (1) (1) 硅胶硅胶G G薄层板活化及层析液的制备：薄层板活化及层析液的制备：层析液的层析液的制备制备 层析缸层析缸 10 mL10 mL丙酮丙酮石油醚石油醚轻轻轻轻

8、振荡振荡盖上层盖上层析缸盖析缸盖静置静置 101015 min15 min(2(23)3)层析液层析液6/12在线答疑：在线答疑：wy- wy- 大大学学通通用用化化学学实实验验技技术术薄层色谱法分离鉴定叶绿素薄层色谱法分离鉴定叶绿素(3)(3) 展开：展开：(4)(4) 鉴定：鉴定：液面不能液面不能 超超过点样线过点样线 点好样的点好样的硅胶玻片硅胶玻片 层析缸层析缸 盖好盖子盖好盖子 进行上行层析进行上行层析 待展开剂上升到终点线待展开剂上升到终点线附近时附近时( (约约202030 min) 30 min) 取出并在通风橱内晾干取出并在通风橱内晾干 要尽可能多地分要尽可能多地分离叶片各种

9、色素离叶片各种色素观察各斑点的颜色观察各斑点的颜色 计算比移值计算比移值R Rf f Rf =样品中某组分移动离开原点的距离样品中某组分移动离开原点的距离展开剂前沿距原点中心的距离展开剂前沿距原点中心的距离7/12在线答疑：在线答疑：wy- wy- 大大学学通通用用化化学学实实验验技技术术薄层色谱法分离鉴定叶绿素薄层色谱法分离鉴定叶绿素4. 4. 叶绿体色素的光谱表征：叶绿体色素的光谱表征：将层析板上分开的将层析板上分开的叶绿素叶绿素a a和叶绿素和叶绿素b b的色带的色带 分别用干净刮刀分别用干净刮刀 刮入试管刮入试管 5 5 mLmL 80% 80%丙酮溶液丙酮溶液 通过紫外可见光谱法通过

10、紫外可见光谱法 进行定性鉴定进行定性鉴定 提取提取 橙黄色橙黄色-胡萝卜素胡萝卜素灰色的去镁叶绿素灰色的去镁叶绿素蓝绿色的叶绿素蓝绿色的叶绿素a a黄绿色的叶绿素黄绿色的叶绿素b b自上而下自上而下8/12在线答疑：在线答疑：wy- wy- 大大学学通通用用化化学学实实验验技技术术薄层色谱法分离鉴定叶绿素薄层色谱法分离鉴定叶绿素122.4 122.4 注意事项注意事项 (1) (1) 研磨叶片时要将其尽量剪碎，使叶片得到充分研磨叶片时要将其尽量剪碎，使叶片得到充分研磨；研磨至叶片发白为止。研磨；研磨至叶片发白为止。 (2) (2) 层析液倒入层析缸后，盖上盖子，让其气相饱层析液倒入层析缸后，盖

11、上盖子，让其气相饱和和10 min10 min以上，否则分离效果不佳。以上，否则分离效果不佳。 (3) (3) 薄层色谱点样时，尽量使斑点小，直径不超过薄层色谱点样时，尽量使斑点小，直径不超过5 5 mmmm，若斑点颜色较浅，可反复点直至其呈深绿色。，若斑点颜色较浅，可反复点直至其呈深绿色。 (4) (4) 大叶黄杨叶薄层色谱分离一般可得橙黄色大叶黄杨叶薄层色谱分离一般可得橙黄色-胡胡萝卜素、灰色的去镁叶绿素、蓝绿色的叶绿素萝卜素、灰色的去镁叶绿素、蓝绿色的叶绿素a a及黄绿色及黄绿色的叶绿素的叶绿素b b色带。色带。9/12在线答疑：在线答疑：wy- wy- 大大学学通通用用化化学学实实验验

12、技技术术薄层色谱法分离鉴定叶绿素薄层色谱法分离鉴定叶绿素122.5 122.5 问题讨论问题讨论 (1) (1) 绿色植物叶片的主要成分是什么？提取液可能绿色植物叶片的主要成分是什么？提取液可能含有哪些化合物？含有哪些化合物？ (2) (2) 薄层色谱分离色素原理是什么？薄层色谱分离色素原理是什么？ (3) (3) 试比较叶绿素试比较叶绿素a a、叶绿素、叶绿素b b和和-胡萝卜素的极性，胡萝卜素的极性，为什么为什么-胡萝卜素在薄层板上移动最快？胡萝卜素在薄层板上移动最快？10/12在线答疑：在线答疑：wy- wy- 大大学学通通用用化化学学实实验验技技术术薄层色谱法分离鉴定叶绿素薄层色谱法分

13、离鉴定叶绿素122.6 122.6 参考答案参考答案 (1) (1) 绿色植物叶片的主要成分是什么？提取液可能绿色植物叶片的主要成分是什么？提取液可能含有哪些化合物？含有哪些化合物？ 答：色素主要成分有脂溶性和水溶性色素，脂溶性答：色素主要成分有脂溶性和水溶性色素，脂溶性色素主要为叶绿素与类胡萝卜色素主要为叶绿素与类胡萝卜素，水溶性色素主要为花素，水溶性色素主要为花色甙类，又称花青素。提取液可能含脂溶性色素。色甙类，又称花青素。提取液可能含脂溶性色素。11/12在线答疑：在线答疑：wy- wy- 大大学学通通用用化化学学实实验验技技术术薄层色谱法分离鉴定叶绿素薄层色谱法分离鉴定叶绿素 (2) (2) 薄层色谱分离色素原理是什么？薄层色谱分离色素原理是什么？ 答：答：薄层色谱分离色素原理是利用不同色素在各种薄层色谱分离色素原理是利用不同色素在各种有机溶剂中的分配系数或在吸附有机溶剂中的分配系数或在吸附剂上的吸附能力的不同，剂上的吸附能力的不同，当它们通过薄层板时，这种分配或吸附过程反复多次当它们通过薄层板时，这种分配或吸附过程反复多次 地进行，最后将它们一一分离开来。地进行，最后将它们一一分离开来。12/12在线答疑：在线答疑：wy- wy- 大大学学通通用用化化学学实实验验技技术术薄层