高通量药物筛选教学内容

1、高通量药物筛选制药产业制药产业是高风险、高投人、高回报的产业。是高风险、高投人、高回报的产业。据统计，目前平均每个新药上市需耗时据统计，目前平均每个新药上市需耗时712年年.耗资耗资1-1.24亿美元，而亿美元，而I期临床试期临床试验通过率仅为验通过率仅为8.3。如何加快新药发现。如何加快新药发现的速度，增加可进人新药开发阶段的新化的速度，增加可进人新药开发阶段的新化学实体学实体(NCE)的数量，是当今新药研究所的数量，是当今新药研究所面临的重点和难点。面临的重点和难点。先导化合物发现先导化合物发现即偶然发现即偶然发现药物筛选，药物筛选，偶然发现并不可靠，药物筛选才是药物研究中极其偶然发现并不

2、可靠，药物筛选才是药物研究中极其重要的内容。重要的内容。 创新药物研究的关键在于药物的发现，这已经成为不争创新药物研究的关键在于药物的发现，这已经成为不争的认识，一旦确定药物的候选化合物的认识，一旦确定药物的候选化合物. .其研究工作的目标其研究工作的目标就已经明确，研究的方法也就有据可依。但是，药物的发就已经明确，研究的方法也就有据可依。但是，药物的发现则是不可控的过程，具有极大的随机性。现则是不可控的过程，具有极大的随机性。药物筛选，药物筛选，就是对可能作为药用的物质进行初步药理活性就是对可能作为药用的物质进行初步药理活性的检测和试验，以求发现其药用价值和临床用的检测和试验，以求发现其药用

3、价值和临床用途，为发展新药提供最初始的依据和资料。途，为发展新药提供最初始的依据和资料。根据所选材料和药物作用对象，药物筛选大致根据所选材料和药物作用对象，药物筛选大致分为两类：分为两类：动物实验动物实验(包括动物整体筛选和组织器官筛选包括动物整体筛选和组织器官筛选)细胞分子水平筛选，细胞分子水平筛选，2种筛选方法的特点优优 点点 缺缺 点点举举 例例动物实验动物实验比较反映整体治疗作用、比较反映整体治疗作用、不良反应和毒性作用不良反应和毒性作用劳动强度劳动强度大。技术大。技术要求高，要求高，样品量大样品量大离体血离体血管试验管试验细胞分子细胞分子水平筛选水平筛选能直接反映药物作用机能直接反映

4、药物作用机理，操作随机撼化、隘理，操作随机撼化、隘量化、自动动强度大量化、自动动强度大不能直接不能直接反映药物反映药物作用作用高通量高通量筛选筛选高通量筛选高通量筛选 (high throughput screening)近年来。细胞生物学、分子药理学、生物化学近年来。细胞生物学、分子药理学、生物化学及病理学等学科的发展，为观察药物作用提供及病理学等学科的发展，为观察药物作用提供了新的方法，大量分子细胞水平的药物筛选模了新的方法，大量分子细胞水平的药物筛选模型不断出现，并应用到药物筛选和研究中，使型不断出现，并应用到药物筛选和研究中，使细胞分子水平筛选方法能真正实现一物多筛和细胞分子水平筛选方

5、法能真正实现一物多筛和多物一筛，并配合组合化学技术、灵敏的检测多物一筛，并配合组合化学技术、灵敏的检测技术、微电子技术、自动化技术和计算机技术技术、微电子技术、自动化技术和计算机技术而形成高通量筛选，极大的减少了供试化合物而形成高通量筛选，极大的减少了供试化合物和试剂的用量和试剂的用量(最低用量为最低用量为10L)，降低药物筛，降低药物筛选的成本，实现了每日筛选选的成本，实现了每日筛选10万化合物的目标，万化合物的目标，成为新药发现的强大武器。成为新药发现的强大武器。HTS的定义的定义就是以分子细胞水平的实验方法为基础，以微就是以分子细胞水平的实验方法为基础，以微型板为实验工具载体、以自动化操

6、作系统执行型板为实验工具载体、以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，同时对数以万计的样品进行检测。同时对数以万计的样品进行检测。高通量药物筛选，使药物筛选的工作进入一个高通量药物筛选，使药物筛选的工作进入一个新的阶段。高通量药物筛选的实现，将会大幅新的阶段。高通量药物筛选的实现，将会大幅度地缩短新药发现的时间，提高筛选效率，增度地缩短新药发现的时间，提高筛选效率，增加高特异性高生物活性药物的发现率。加高特异性高生物活性药物的发现率。HTS的组成：的组

7、成：供试的大量样品供试的大量样品(即样品库即样品库)；分子细胞水平的特异性体外体内筛选模分子细胞水平的特异性体外体内筛选模型；型；高灵敏度检测系统；高灵敏度检测系统；自动化操作系统；自动化操作系统；数据采集传输处理系统。数据采集传输处理系统。此外，还有计算机辅助设计、组合化学、此外，还有计算机辅助设计、组合化学、高效天然化合物提取方法等辅助系统。高效天然化合物提取方法等辅助系统。1 供试的大量祥品供试的大量祥品已有的化合物库已有的化合物库天然产物天然产物组合化学库组合化学库 1.1 已有的化合物库已有的化合物库 一些大制药公司搜集大量不同结构的有机化合一些大制药公司搜集大量不同结构的有机化合物

8、，如物，如Exielixis公司已建立了一个超过公司已建立了一个超过2106个化合物的特大型化合物库。这些化合物绝大个化合物的特大型化合物库。这些化合物绝大部分是小分子，容易筛选出具有潜在类似化合部分是小分子，容易筛选出具有潜在类似化合物的合成和筛选。物的合成和筛选。1.2 天然产物天然产物 长期以来，植物成分是开发新药的最重长期以来，植物成分是开发新药的最重要的来源，如吗啡、喳琳、喳尼丁和阿要的来源，如吗啡、喳琳、喳尼丁和阿托品等均来自于植物。微生物代谢也是托品等均来自于植物。微生物代谢也是新药的一个重要来源，如青霉素等。此新药的一个重要来源，如青霉素等。此外，海洋生物占全球生物多样性的一半

9、，外，海洋生物占全球生物多样性的一半，估计有估计有300万一万一500万，是另一类巨大的万，是另一类巨大的宝藏。宝藏。1.3 组合肽库组合肽库 组合肽库的合成技术主要采用组合肽库的合成技术主要采用“一珠一一珠一肽肽”，生物学法和同步合成法，但因肽，生物学法和同步合成法，但因肽仅仅由仅仅由20种真核氨基酸合成而受限制，种真核氨基酸合成而受限制，筛选方法也仅限于结合检测。筛选方法也仅限于结合检测。2、分子细胞水平的特异性体外筛、分子细胞水平的特异性体外筛选模型选模型2.1 分子水平的药物筛选模型分子水平的药物筛选模型 这是这是HTS中使用最多的模型。根据生物中使用最多的模型。根据生物分子的类型，分

10、子水平的药物筛选模型分子的类型，分子水平的药物筛选模型主要分为受体、酶、通道、基因和其他主要分为受体、酶、通道、基因和其他类型的模型，其特点是药物作用靶标明类型的模型，其特点是药物作用靶标明确，应用这些模型可以直接得到药物作确，应用这些模型可以直接得到药物作用机理的信息用机理的信息2.1.1 受体筛选模型受体筛选模型 受体筛选模型典型的是受体与放射性配受体筛选模型典型的是受体与放射性配体结合模型。其过程一般是让受体、配体结合模型。其过程一般是让受体、配体、供试化合物和必要的辅助因子一起体、供试化合物和必要的辅助因子一起加入到适当的缓冲液中，温孵一定时间加入到适当的缓冲液中，温孵一定时间使结合反

11、应达到平衡，随后通过过滤分使结合反应达到平衡，随后通过过滤分离结合和游离的配体，然后将滤纸烘干，离结合和游离的配体，然后将滤纸烘干，滤纸上残留的即为结合的放射性配体，滤纸上残留的即为结合的放射性配体，这可用液体闪烁计数来测量结合的放射这可用液体闪烁计数来测量结合的放射性配基。性配基。2.1.2 酶筛选模型酶筛选模型 筛选作用于酶的药物，主要是观察药物筛选作用于酶的药物，主要是观察药物对面活性的影响。根据酶的特点，酶的对面活性的影响。根据酶的特点，酶的反应底物，产物都可以作为检测指标，反应底物，产物都可以作为检测指标，并由此确定反应速度。典型的酶筛选包并由此确定反应速度。典型的酶筛选包括括3个部

12、分：个部分：1)让被测化合物在适当缓冲液中孵化；让被测化合物在适当缓冲液中孵化；2)反应起始后反应起始后(可以加金属离子或蛋白质激可以加金属离子或蛋白质激活剂活剂)可以通过改变反应混合物的温度，缓可以通过改变反应混合物的温度，缓冲液的冲液的pH值和酶的浓度来控制反应速度值和酶的浓度来控制反应速度.3)如果是单时间点数器，反应必须终止，且如果是单时间点数器，反应必须终止，且需测量产物的增加和底物的减少。需测量产物的增加和底物的减少。2.1.3 离子通道筛选模型离子通道筛选模型 Negri (1998)建立了贝类动物毒素的建立了贝类动物毒素的HTS方法。其作用靶标为钠通道上的蛤方法。其作用靶标为钠

13、通道上的蛤蚌毒素蚌毒素(STx)结合位点，用放射性配体结合位点，用放射性配体(3HSTx)进行竞争性结合试验考察受试样进行竞争性结合试验考察受试样品。品。Young等用酵母双杂交的方法等用酵母双杂交的方法HTS干扰干扰N型钙通道民亚单位与型钙通道民亚单位与1亚单位相互作亚单位相互作用的小分子，寻找新型钙通道拮抗剂。用的小分子，寻找新型钙通道拮抗剂。2.2 细胞水平药物筛选模型细胞水平药物筛选模型 该模型是观察被筛样品对细胞的作用，该模型是观察被筛样品对细胞的作用，但不能反映药物作用的具体途径和靶标，但不能反映药物作用的具体途径和靶标，只能反映出药物对细胞生长等过程的综只能反映出药物对细胞生长等

14、过程的综合作用。所以当已知单一确切的与治疗合作用。所以当已知单一确切的与治疗相关的靶标后就不适合于初筛。这些模相关的靶标后就不适合于初筛。这些模型中最重要的是报告基因测定。型中最重要的是报告基因测定。由于转录因子和基因表达相关因子是药由于转录因子和基因表达相关因子是药物作用的重要靶标，从而出现了报告基物作用的重要靶标，从而出现了报告基因法。如果把靶基因表达的调控序列与因法。如果把靶基因表达的调控序列与编码某种酶活性的基因相连，转入细胞编码某种酶活性的基因相连，转入细胞内，通过简单地检测酶活性的变化，就内，通过简单地检测酶活性的变化，就可以反映化合物对转录因子和基因表达可以反映化合物对转录因子和

15、基因表达的作用性质和程度，一般把这种能间接的作用性质和程度，一般把这种能间接反映基因转录水平的编码某种酶的基因反映基因转录水平的编码某种酶的基因称为基因报告法。称为基因报告法。在应用时，首先确定构建模型所需的调在应用时，首先确定构建模型所需的调控序列，然后根据具体情况选择载体控序列，然后根据具体情况选择载体c6I。应用最普遍的有荧光素酶基因、应用最普遍的有荧光素酶基因、p-半乳半乳糖昔酶基因糖昔酶基因(p-Cal)和氯霉素已酰转移酶和氯霉素已酰转移酶基因基因(CAT)。除了报告基因法外，还有细。除了报告基因法外，还有细胞增殖测定、细胞基础的生理测定和黑胞增殖测定、细胞基础的生理测定和黑色素色素

16、色素色素-易位测定等。易位测定等。高灵敏的检测系统高灵敏的检测系统 为了能够针对上述的各种作用靶点，对大为了能够针对上述的各种作用靶点，对大量化合物进行快速、高效、低成本、微量化合物进行快速、高效、低成本、微量化的筛选，建立了许多新的检测方法，量化的筛选，建立了许多新的检测方法，特别是荧光技术和放射性同位素技术的特别是荧光技术和放射性同位素技术的应用和发展，适应并加速了应用和发展，适应并加速了HTS的发展。的发展。3.1 荧光分析法荧光分析法均相时间分辨荧光分析法均相时间分辨荧光分析法荧光偏振法荧光偏振法时间分辨荧光能量传递分析法时间分辨荧光能量传递分析法其它荧光光谱法其它荧光光谱法均相时间分

17、辨荧光分析法均相时间分辨荧光分析法 均相时间分辨荧光分析法均相时间分辨荧光分析法(HTRF)采用脉采用脉冲激光作为光源，激光照射样品后所发冲激光作为光源，激光照射样品后所发射的荧光是一混合光，但由于待测组分射的荧光是一混合光，但由于待测组分的荧光具有特定的衰变期，可根据时间的荧光具有特定的衰变期，可根据时间变化灵敏地检测到待测样品的荧光变化变化灵敏地检测到待测样品的荧光变化而不受其他组分、杂质荧光及仪器噪音而不受其他组分、杂质荧光及仪器噪音等干扰。这项技术具有采取均相测定模等干扰。这项技术具有采取均相测定模式，自动化，非同位素和使用荧光标签式，自动化，非同位素和使用荧光标签等优点。等优点。荧光

18、偏振法荧光偏振法 荧光偏振荧光偏振 (FP)在分析生物和化学体系中在分析生物和化学体系中的分子间相互作用时是一种强有力的、的分子间相互作用时是一种强有力的、快速的技术，它可以根据示踪剂在游离快速的技术，它可以根据示踪剂在游离和与靶标分子结合两种状态时的旋转散和与靶标分子结合两种状态时的旋转散射系数的变化加以区分射系数的变化加以区分时间分辨荧光能量传递分析法时间分辨荧光能量传递分析法 是一种双标记方法，其原理是在荧光铡是一种双标记方法，其原理是在荧光铡系复合物和共振能量受体之间的长范围系复合物和共振能量受体之间的长范围能量传递。能量传递。TRET是完全在液态下进行的，是完全在液态下进行的，不需固

19、定相支持和分离步骤，也不需对不需固定相支持和分离步骤，也不需对试剂特殊处理、检测或沉淀。其优点是试剂特殊处理、检测或沉淀。其优点是通过减少背景使长期存在的供体和受体通过减少背景使长期存在的供体和受体信号的时间门控显示很高的敏感性。信号的时间门控显示很高的敏感性。其它荧光光谱法其它荧光光谱法荧光共振能量传递法荧光共振能量传递法(FRET)荧光关联光谱法荧光关联光谱法(FCS) 量子点荧火光谱法量子点荧火光谱法3.2 微型化放射技术微型化放射技术 虽然荧光检测技术是虽然荧光检测技术是HTS的发展趋势，的发展趋势，并越来越受重视，但是放射性检测技术并越来越受重视，但是放射性检测技术仍然在仍然在HTS

20、中发挥重要作用，估计现在中发挥重要作用，估计现在仍占仍占HTS量的量的20一一50。 闪烁接近分析法闪烁接近分析法 闪烁接近分析法闪烁接近分析法(SPA)利用含闪烁剂的微小球利用含闪烁剂的微小球(闪烁球闪烁球)，经过化学处理这种小球能使靶标分，经过化学处理这种小球能使靶标分子子(抗体，受体蛋白质和酶抗体，受体蛋白质和酶)偶合到达其表面偶合到达其表面.如果以如果以1H或，或，131I标记的分子直接或通过偶合标记的分子直接或通过偶合分子的相互作用结合到闪烁球表面、当它靠分子的相互作用结合到闪烁球表面、当它靠得足够近以致发射的能量能激活闪烁球上的得足够近以致发射的能量能激活闪烁球上的闪烁剂而产生光信

21、号，而产生光信号的多少闪烁剂而产生光信号，而产生光信号的多少与标记分子结合到闪烁球上的数量成正比，与标记分子结合到闪烁球上的数量成正比，并被闪烁球计数器方便的测量。并被闪烁球计数器方便的测量。3.3 细胞基础的放射性技术细胞基础的放射性技术 HTS细胞分析分为三大类：细胞分析分为三大类：监测信号转导激活细胞表面的受体的第二信监测信号转导激活细胞表面的受体的第二信使分析；使分析；在转录或翻译水平监测细胞反应的报告基因在转录或翻译水平监测细胞反应的报告基因分析；分析；探测细胞对外部刺激生长反应的细胞增殖分探测细胞对外部刺激生长反应的细胞增殖分析。析。3.4 微流芯片筛选技术微流芯片筛选技术近来，微

22、流芯片的发展可能会导致高通量筛选近来，微流芯片的发展可能会导致高通量筛选技术的新变化。微流芯片技术利用半导体工业技术的新变化。微流芯片技术利用半导体工业中的影印石版和蚀刻技术，在玻璃或熔融石英中的影印石版和蚀刻技术，在玻璃或熔融石英底物上制作底物上制作10100nm的微流通路，利用电动的微流通路，利用电动泵和水压来控制纳升级的液体流动，使样品的泵和水压来控制纳升级的液体流动，使样品的平行处理和减少试剂的消耗，以及同时完成分平行处理和减少试剂的消耗，以及同时完成分析检测和提高数据质量成为可能。多种不同分析检测和提高数据质量成为可能。多种不同分析模式已经在其原型仪器上证明切实可行，包析模式已经在其

23、原型仪器上证明切实可行，包括结合分析，酶分析和细胞析括结合分析，酶分析和细胞析自动化操作系统自动化操作系统 自动化操作系统就是实验室自动化站，其自动化操作系统就是实验室自动化站，其基本功能就是自动连续地完成实验的基基本功能就是自动连续地完成实验的基本操作，即本操作，即加样；加样；稀释；稀释；转移；转移；混合，其方式包括震荡，也可以用加混合，其方式包括震荡，也可以用加样器反复吹洗混合；样器反复吹洗混合；洗板，就是用适洗板，就是用适当的溶剂清洗微板；当的溶剂清洗微板；温孵；温孵；检测，检测，反应体系与一种或多种检测仪器相连，反应体系与一种或多种检测仪器相连，在反应完成后进行自动检测并自动采集在反应

24、完成后进行自动检测并自动采集储存数据，完成整个实验过程。储存数据，完成整个实验过程。数据采集处理系统数据采集处理系统 首先，由检测系统自动采集和记录数据；首先，由检测系统自动采集和记录数据；其次，由计算机进行其次，由计算机进行HTS实验数据的分实验数据的分析，包括析，包括HTS的质量评价、的质量评价、HTS活性计活性计算方法的选择和药物活性数据的储存算方法的选择和药物活性数据的储存.再次，就是再次，就是HTS报告的给出最后就是报告的给出最后就是HTS活性数据库的管理和使用。活性数据库的管理和使用。计算机技术在高通量药物筛选计算机技术在高通量药物筛选在高通量药物筛选中，几乎全部过程都在高通量药物

25、筛选中，几乎全部过程都与计算机技术密切相关，如样品的管理，与计算机技术密切相关，如样品的管理，操作过程的控制，筛选结果的分析和处操作过程的控制，筛选结果的分析和处理等等。计算机技术促进了高通量药物理等等。计算机技术促进了高通量药物筛选的实现；筛选的实现；此外，以计算机技术为基础辅助筛选方此外，以计算机技术为基础辅助筛选方法法(又称理性筛选又称理性筛选)，在高通量药物筛选中，在高通量药物筛选中也逐渐发挥重要作用。计算机辅助筛选也逐渐发挥重要作用。计算机辅助筛选的基本方法是根据药物作用靶点与药物的基本方法是根据药物作用靶点与药物小分子结合的原理，通过结构模拟、立小分子结合的原理，通过结构模拟、立体

26、结构对接、分子间能量计算、分子相体结构对接、分子间能量计算、分子相互作用力的预测等手段，寻找能够与特互作用力的预测等手段，寻找能够与特定药物作用靶点相互作用的小分子结构，定药物作用靶点相互作用的小分子结构，作为药物研究的对象。作为药物研究的对象。HTS自提出之日起就显示了强大的生命自提出之日起就显示了强大的生命力，近力，近10年来的发展更确定了其无可比年来的发展更确定了其无可比拟的优势。西方国家的大制药公司纷纷拟的优势。西方国家的大制药公司纷纷投入巨资，研究和开发投入巨资，研究和开发HTS技术并利用技术并利用它进行日常筛选。它进行日常筛选。在国内开展这方面工作有很大难度。但在国内开展这方面工作

27、有很大难度。但是由于其重要性已受到了我国政府的高是由于其重要性已受到了我国政府的高度重视，现已建成度重视，现已建成以中国科学院上海药物研究所为依托单位，以中国科学院上海药物研究所为依托单位，符合国际标准的国家新药筛选中心；符合国际标准的国家新药筛选中心；分别以中国医学科学院药物研究所、医药生分别以中国医学科学院药物研究所、医药生物技术研究所、北京大学医学部、福建微生物技术研究所、北京大学医学部、福建微生物研究所为依托单位的物研究所为依托单位的4个新药筛选重点实个新药筛选重点实验室。验室。“九五九五”期间，国家新药筛选中心和各新药筛选重期间，国家新药筛选中心和各新药筛选重点实验室研究建立和引进微

28、量、快速、简便的筛选点实验室研究建立和引进微量、快速、简便的筛选方法与模型方法与模型400余种，国家新药筛选中心建立了一余种，国家新药筛选中心建立了一批全新的分子水平和细胞水平的药物筛选模型，并批全新的分子水平和细胞水平的药物筛选模型，并已投入到高通量药物筛选中已投入到高通量药物筛选中.F国家新药筛选中心现有高通量筛选模型国家新药筛选中心现有高通量筛选模型50种，种，涵盖蛋白酶、细胞膜受体涵盖蛋白酶、细胞膜受体 和细胞核受体等分子和细胞核受体等分子靶点。筛选中心常用的高通量筛选模型举例如靶点。筛选中心常用的高通量筛选模型举例如下下：J (1) 人源基质金属蛋白酶人源基质金属蛋白酶(MMPs；结

29、缔组织疾病和肿瘤；结缔组织疾病和肿瘤转移转移) J (2) 蛋白酪氨酸磷酸酯酶蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B (PTP1B；糖尿病；糖尿病) J (3) 大肠杆菌、真菌、人源甲硫氨酸氨肽酶大肠杆菌、真菌、人源甲硫氨酸氨肽酶(MetAPs; 肿瘤新生血管生成和病原微生物感染肿瘤新生血管生成和病原微生物感染)；J (4) 蛋白酪氨酸磷酸酯酶蛋白酪氨酸磷酸酯酶(cdc25A, B; 肿瘤细胞周期调肿瘤细胞周期调控控)；J (5) 雌激素受体雌激素受体a, b、孕激素受体、孕激素受体a, b和雄激素受体（和雄激素受体（前景前景人类基因组计划的完成药学研究进入新的阶段人类基因组计划的完成药学研究进入新的阶段 人类基因组计划的完成，使人类对生