第三章酶的分离纯化-华工(1)

1、第二章第二章 酶的分离纯化酶的分离纯化酶分离纯化的特点酶分离纯化的特点 酶分离纯化的目的是使酶制剂产品达到所需的纯度。酶分离纯化的目的是使酶制剂产品达到所需的纯度。包括包括4个基本步骤：预处理、粗提、精制、成品加工个基本步骤：预处理、粗提、精制、成品加工。在分离纯化中必须注意：在分离纯化中必须注意：1、防止酶的变性失活；、防止酶的变性失活；2、在分离纯化过程中的每一步都应检测酶的活性，、在分离纯化过程中的每一步都应检测酶的活性，确定酶的纯化程度和回收率。确定酶的纯化程度和回收率。主要内容主要内容 第一节第一节 发酵液预处理发酵液预处理 第二节第二节 细胞破碎细胞破碎 第三节第三节 酶的提取酶的

2、提取 第四节第四节 酶分离纯化的方法酶分离纯化的方法 (一一) 沉淀分离沉淀分离 (二二) 离心分离离心分离 (三三) 过滤与膜分离过滤与膜分离 (四四) 层析分离层析分离 (五五) 电泳分离电泳分离 (六六) 萃取分离萃取分离 第五节第五节 酶的结晶酶的结晶 第六节第六节 酶的浓缩干燥酶的浓缩干燥 第七节酶的制剂与保存第七节酶的制剂与保存第一节第一节 发酵液的预处理发酵液的预处理 预处理目的预处理目的 a 改变发酵液物理性质改变发酵液物理性质 b 产物转入液相中产物转入液相中 c 除去发酵液中部分杂质除去发酵液中部分杂质 发酵液中的发酵液中的杂质杂质如高价无机离子如高价无机离子(Ca2+、M

3、g2+、Fe3+)和和蛋白质蛋白质在离子交换的过程中对提炼影响甚大，在离子交换的过程中对提炼影响甚大，不利于树脂对酶的吸附。如用溶媒萃取法提炼时，不利于树脂对酶的吸附。如用溶媒萃取法提炼时，蛋白质的存在会产生乳化，使溶媒和水相分层困难。蛋白质的存在会产生乳化，使溶媒和水相分层困难。1、发酵液相对纯化、发酵液相对纯化（1）无机离子的去除）无机离子的去除 Ca2+ 草酸草酸 Mg2+ 三聚磷酸钠三聚磷酸钠 Fe3+ 黄血盐黄血盐 对高价离子的去除，可采用对高价离子的去除，可采用草酸或磷酸草酸或磷酸。加草酸则它与钙离子生成的草酸钙还能促使蛋加草酸则它与钙离子生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固以提高发酵滤

4、液的质量。白质凝固以提高发酵滤液的质量。加磷酸加磷酸(或磷酸盐或磷酸盐)，则既能降低钙离子浓度，也易于，则既能降低钙离子浓度，也易于去除镁离子。去除镁离子。 Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+ 加黄血盐及硫酸锌，则前者有利于去除铁离子，后加黄血盐及硫酸锌，则前者有利于去除铁离子，后者有利于凝固蛋白质。此外，这二者还有协同作用。者有利于凝固蛋白质。此外，这二者还有协同作用。它们所产生的复盐对蛋白质有吸附作用。它们所产生的复盐对蛋白质有吸附作用。2K4Fe(CN)6+3ZnSO4K2Zn3Fe(CN)62+3K2SO4 （2）蛋白质去除）蛋白质去除加热加热调调pH (草酸，

5、无机酸或碱草酸，无机酸或碱)凝集凝集/絮凝絮凝/混凝混凝添加助滤剂添加助滤剂添加反应剂添加反应剂 凝聚：凝聚：胶体粒子胶体粒子(10-100nm)中性盐促进下脱稳相中性盐促进下脱稳相 互聚集成大粒子（互聚集成大粒子（1mm）机理：机理：a 中和粒子表面电荷中和粒子表面电荷 b 消除双电层结构消除双电层结构 絮凝：絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，成大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，成形絮凝团的过程形絮凝团的过程机理：架桥作用机理：架桥作用（3）色素及其他物质的去除）色素及其他物质的去除2、发酵液的固液分离、发酵液的固液分离 （1）影响发酵液过滤的因素）影响发酵液过滤的因素 菌种：真菌

6、，放线菌，细菌菌种：真菌，放线菌，细菌 培养基：黄豆，花生，淀粉，后期加油，培养基未培养基：黄豆，花生，淀粉，后期加油，培养基未用完用完 发酵时间：菌丝自溶前放罐发酵时间：菌丝自溶前放罐（2）改善过滤方法）改善过滤方法 助滤剂助滤剂：质地坚硬不可压缩性固体：质地坚硬不可压缩性固体机理：机理：表面吸附胶体及不可压缩型格子结构表面吸附胶体及不可压缩型格子结构使用方法：使用方法：a 预先制成滤饼预先制成滤饼b 助滤剂混入悬浮液中一起过滤助滤剂混入悬浮液中一起过滤 常用助滤剂常用助滤剂：硅藻土，珍珠岩，活性炭：硅藻土，珍珠岩，活性炭应用优化因素应用优化因素 a 单位质量助滤剂的滤液最大产量单位质量助滤

7、剂的滤液最大产量 b 使用周期使用周期 c 流速流速 第二节第二节 细胞破壁细胞破壁 生物细胞产酶有两类生物细胞产酶有两类 胞内酶：大多为水解酶类胞内酶：大多为水解酶类 胞外酶：数量较多胞外酶：数量较多细胞破碎细胞破碎许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细胞破碎珠细胞破碎珠高压细胞破碎机高压细胞破碎机DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机机械破碎机械破

8、碎捣碎法捣碎法研磨法研磨法匀浆法匀浆法 物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法 化学破碎化学破碎有机溶剂：有机溶剂：甲苯、丙酮甲苯、丙酮丁醇、氯仿丁醇、氯仿表面活性剂：表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制剂法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用

9、，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理本章本章目录目录细胞破碎的方法细胞破碎的方法A 机械破碎法机械破碎法 1、机械捣碎法：高速组织捣碎机、机械捣碎法：高速组织捣碎机 2、研磨破碎法：高速球磨机，研钵研磨、研磨破碎法：高速球磨机，研钵研磨 3、匀浆破碎法：玻璃、匀浆破碎法：玻璃、Teflon研钵匀浆器研钵匀浆器 B 物理破碎法物理破碎法 1、温度差、温度差 2、压力差：高压冲击法、压力差：高压冲击法 降压法降压法 渗透压

10、变化法渗透压变化法 3、超声波、超声波 4、其它：冻融法、干燥法、其它：冻融法、干燥法压挤高压匀浆冻融法冻融法 生物组织经冰冻后，细胞胞液结成冰晶，生物组织经冰冻后，细胞胞液结成冰晶，使细胞壁涨破。使细胞壁涨破。 需在冻融液中加入蛋白酶抑制剂。需在冻融液中加入蛋白酶抑制剂。干燥法干燥法 经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。物质就会被抽提出来。 干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易干燥法属于较激烈的

11、一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性。引起蛋白质或其它组分变性。 C 化学破碎法化学破碎法 1、添加有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿、添加有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿 2、添加表面活性剂：特里顿、吐温、添加表面活性剂：特里顿、吐温D 酶促破碎法酶促破碎法 1、自溶法、自溶法 2、外加酶制剂法、外加酶制剂法 在众多的细胞破碎方法中高压均浆和珠磨两种机械在众多的细胞破碎方法中高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛。长上应用最广泛。 但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使但在机械法破碎过程中，容易产

12、生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏。料液温度升高，而易造成生化物质的破坏。 非机械法一般仅适用于小规模应用。非机械法一般仅适用于小规模应用。 超声波处理容易使料液温度升高。因此，超声波振超声波处理容易使料液温度升高。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。 渗透压冲击和冻结渗透压冲击和冻结-融解法都属于较温和的方法，但融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。破碎效果。 干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白干燥法属于较激烈的一种破碎

13、方法，容易引起蛋白质或其它组分变性。质或其它组分变性。 破碎率的评价破碎率的评价 直接计数直接计数 （1）计数器）计数器 （2）平板计数）平板计数 （3）显微镜）显微镜 间接计数间接计数 （1） 活性测定活性测定 （2） 电导率测定电导率测定 破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：的百分比数，即： Y(%)=(N0-N)/N0100 N0原始细胞数量原始细胞数量N经经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量量 目前目前N0和和N主要通过下面的方法获得主要通过下面的方法获得 ： 直接计数直接计数法在

14、血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释法在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。后的样品进行计数。 间接计数法间接计数法是在细胞破碎后，测定悬间接计数法间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量。浮液中细胞释放出来的化合物的量。 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂剂。一般

15、说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用则可用有机溶剂提取有机溶剂提取。 第三节酶溶液的提取第三节酶溶液的提取1、提取的主要方法：、提取的主要方法：提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶

16、剂或溶液提取对象提取对象盐溶液提取盐溶液提取0.020.020.5mol/L0.5mol/L的盐溶的盐溶液液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶较大的酶酸溶液提取酸溶液提取PH2PH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶且稳定性较好的酶碱溶液提取碱溶液提取PH8PH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶稳定性较好的酶有机溶剂提取有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含用于提取那些与脂质结合牢固或含有

17、较多非极性基团的酶有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水，而大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为增加，这称为盐溶现象盐溶现象。 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、在提取过程中还要注意控制

18、好温度、pH值值等提取条件。等提取条件。2 2、酶提取过程的注意事项、酶提取过程的注意事项 (1)盐的选择：盐的选择：大多数酶在低浓度的盐溶液中有较、大多数酶在低浓度的盐溶液中有较、大的溶解度，一般选择等渗盐溶液，如大的溶解度，一般选择等渗盐溶液，如0.02-0.05 mol/L的磷酸缓冲液或的磷酸缓冲液或0.15 mol/L的的NaCl等。等。(2) 温度的选择温度的选择：一般控制在：一般控制在0-10 0C，如果酶比较稳如果酶比较稳定可以例外。定可以例外。(3) pH的选择的选择 ：首先考虑酶的稳定性；其次应远离首先考虑酶的稳定性；其次应远离等电点；一般选择等电点；一般选择pH4-6为宜。

19、为宜。(4) 抽提液用量抽提液用量：常采用原料体积的：常采用原料体积的1-5倍。倍。第四节第四节 酶分离纯化的基本过程酶分离纯化的基本过程酶分离纯化方法的选择酶分离纯化方法的选择 目前酶的分离纯化方法都是根据酶与杂蛋白的性质差异目前酶的分离纯化方法都是根据酶与杂蛋白的性质差异而建立的，在选择分离纯化方法时，要考虑以下几个方面：而建立的，在选择分离纯化方法时，要考虑以下几个方面：1、首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面的了解；、首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面的了解；2、以酶活力和比活力为标准，判断所选择的方法是、以酶活力和比活力为标准，判断所选择的方法是 否得当；否得当；3、严格控制操作条

20、件，防止酶的变性失活。、严格控制操作条件，防止酶的变性失活。层析法层析法 电泳法电泳法 超离心法超离心法 透析和超滤透析和超滤盐析（盐析（硫酸铵盐析硫酸铵盐析）等点电沉淀等点电沉淀有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀离心离心前处理前处理 粗分级粗分级 细分级细分级 材料选择与处理材料选择与处理细胞破碎（机械破碎、细胞破碎（机械破碎、溶涨和自溶、酶解、化溶涨和自溶、酶解、化学处理）学处理）有效成分的抽提有效成分的抽提生物组织生物组织 提取液提取液 粗产品粗产品结晶结晶分子大小分子大小溶解度溶解度电荷性质电荷性质吸附性质吸附性质生物亲和力生物亲和力依据原理依据原理酶分离纯化方法：酶分离纯化方法： 根据根据分子

21、大小分子大小建立的分离纯化方法建立的分离纯化方法 根据根据溶解度溶解度建立的分离纯化方法建立的分离纯化方法 根据根据电荷性质电荷性质建立的分离纯化方法建立的分离纯化方法 根据根据亲和作用亲和作用建立的分离纯化方法建立的分离纯化方法 根据根据稳定性差异稳定性差异建立的分离纯化方法建立的分离纯化方法酶分离纯化过程中一些数据的处理酶分离纯化过程中一些数据的处理 在每一步都要测定在每一步都要测定3个数据：酶活力；个数据：酶活力；比活力；体积。比活力；体积。 性质性质 方法方法v分子大小分子大小 离心分离、凝胶过滤、透析、超滤离心分离、凝胶过滤、透析、超滤v溶解度溶解度 改变离子强度（盐析）；改变离子强

22、度（盐析）； 改变改变pH（等电点沉淀）或温度；（等电点沉淀）或温度； 改变介电常数（有机溶剂沉淀）改变介电常数（有机溶剂沉淀） 萃取分离萃取分离v电荷电荷 电泳（纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、电泳（纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、 凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳） 吸附法（物理吸附法、离子交换层析、吸附法（物理吸附法、离子交换层析、 羟基磷灰石层析）羟基磷灰石层析）v对配体分子对配体分子 亲和层析亲和层析 亲和力亲和力v稳定性差异稳定性差异 热变性、酸碱变性、表面变性热变性、酸碱变性、表面变性酶分离纯化方法的选择根据稳定性的差异建立的分离纯化方法根据稳定性的差异建立的分

23、离纯化方法1、热变性法：热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异 ，可以在较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则，可以在较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。保持可溶状态。2、酸碱变性法：酸碱变性法：与热变性原理类似，目的酶与杂与热变性原理类似，目的酶与杂蛋白的酸碱稳定性不同，可以调整不同的蛋白的酸碱稳定性不同，可以调整不同的pH使杂蛋使杂蛋白变性沉淀。白变性沉淀。3、表面变性法：表面变性法：可将酶溶液与惰性液体混合，振可将酶溶液与惰性液体混合，振荡造成表面变性；如在酶液中加入氯仿，振荡后通荡造成表面变性；如在酶液中加入氯仿，振荡后通常可分为常可分为3层

24、：上面为未变性的酶，中层为乳浊状层：上面为未变性的酶，中层为乳浊状的变性蛋白，下层为氯仿。的变性蛋白，下层为氯仿。(一一) 沉淀分离沉淀分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降溶解度降低低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理 盐析沉淀法盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出过在酶液中添加一定浓度

25、的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pHpH值，使酶或杂值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分量的某种有机溶剂，使酶或杂

26、质沉淀析出，从而使酶与杂质分离离复合沉淀法复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离而使酶与杂质分离选择性变性沉法选择性变性沉法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离所需的酶，从而使酶与杂质分离1、盐析盐析(Salting Out)沉淀法（改变离子强度）沉淀法（改变离子强度）在盐浓度达到某一界限在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为度升高而降低，这称为盐析现象盐析现

27、象。 最常用的是硫酸铵。盐浓度以饱和度表示，饱和最常用的是硫酸铵。盐浓度以饱和度表示，饱和盐溶液的饱和度为盐溶液的饱和度为100%。调整盐浓度有两种方法：。调整盐浓度有两种方法：加入饱和硫酸铵溶液（蛋白质溶液体积不大时）和直加入饱和硫酸铵溶液（蛋白质溶液体积不大时）和直接加入固体硫酸铵（蛋白质溶液体积较大时）。接加入固体硫酸铵（蛋白质溶液体积较大时）。（1 1） KsKs盐析盐析：固定：固定pH, pH, 温度，温度， 改变盐浓度改变盐浓度（2 2） 盐析：盐析：固定离子强度，固定离子强度， 改变改变pH pH 及温度。及温度。基本原理基本原理 有机溶剂对于许多蛋白质有机溶剂对于许多蛋白质(

28、(酶酶),),核酸核酸, ,多糖和多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用小分子生化物质都能发生沉淀作用, ,是较早使用是较早使用的沉淀方法之一的沉淀方法之一. .其原理主要是其原理主要是: :降低水溶液的介电常数降低水溶液的介电常数, , 导致蛋白质溶解度降导致蛋白质溶解度降低而沉淀低而沉淀. . （ F=QF=Q1 1Q Q2 2/r/r2 2 ）由于使用的有机溶剂与水互溶由于使用的有机溶剂与水互溶, ,它们在溶解于它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子分子, ,破坏了蛋白质分子的水膜破坏了蛋白质分子的水膜, ,因而发生沉淀作因而发

29、生沉淀作用用. .2、有机溶剂沉淀法（改变介电常数）、有机溶剂沉淀法（改变介电常数）常用：乙醇常用：乙醇, ,甲醇和丙酮甲醇和丙酮. .分辨能力比盐析法高分辨能力比盐析法高, ,即一种蛋白质或其他溶质即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀. .沉淀不用脱盐沉淀不用脱盐, ,过滤比较容易过滤比较容易( (如有必要如有必要, ,可用透可用透析袋脱有机溶剂析袋脱有机溶剂).).因而在生化制备中有广泛的应因而在生化制备中有广泛的应用用. .有机溶剂沉淀法的优点是有机溶剂沉淀法的优点是: :有机溶剂沉淀法的缺点：有机溶剂沉淀法的缺点：对某些具有

30、生物活性的大分子容易引起变性失活对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活, ,操操作需在低温下进行作需在低温下进行. .1) 1) 温度温度: :酶在有机溶剂中对温度特别敏感酶在有机溶剂中对温度特别敏感, ,温度稍温度稍高就会引起变性高就会引起变性, ,且有机溶剂与水混合时产生放热且有机溶剂与水混合时产生放热反应反应, ,因此有机溶剂必须预冷因此有机溶剂必须预冷, ,操作要在冰盐浴中进操作要在冰盐浴中进行行. .一般都要在低温下进行（一般都要在低温下进行（0011）2) 2) 样品浓度样品浓度: :低浓度样品回收率低低浓度样品回收率低, ,要使用比例更要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀大的有机

31、溶剂进行沉淀. .高浓度样品高浓度样品, ,可以节省有机可以节省有机溶剂溶剂, ,减少变性的危险减少变性的危险, ,但杂蛋白的共沉淀作用大但杂蛋白的共沉淀作用大. .选择适当的蛋白质浓度才能达到较好的分离效果。选择适当的蛋白质浓度才能达到较好的分离效果。通常使用通常使用5 5mg/mLmg/mL20mg/mL20mg/mL的蛋白质初浓度为宜的蛋白质初浓度为宜. . 有机溶剂沉淀的影响因素有机溶剂沉淀的影响因素3、等电点沉淀法（改变、等电点沉淀法（改变pH值）值） 利用两性电解质在等电点时溶解度最低以利用两性电解质在等电点时溶解度最低以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性及不同的两性电解质有

32、不同的等电点这一特性, ,通过调节溶液的值，使酶或杂质沉淀析出，从通过调节溶液的值，使酶或杂质沉淀析出，从而实现酶与杂质分离的方法而实现酶与杂质分离的方法. . 可以利用此法进行初步的沉淀分离可以利用此法进行初步的沉淀分离. . 由于许多蛋白质的等电点十分接近由于许多蛋白质的等电点十分接近, ,而且而且带有水膜的酶等生物大分子仍有一定的溶解度带有水膜的酶等生物大分子仍有一定的溶解度, ,不能完全沉淀析出不能完全沉淀析出, ,因此因此, ,单独使用此法分辨率单独使用此法分辨率较低较低, ,因而此法常与盐析法因而此法常与盐析法, ,有机溶剂沉淀法或有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用其他沉淀剂一

33、起配合使用, ,以提高沉淀能力和以提高沉淀能力和分离效果分离效果. . 此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白白, ,而不用于沉淀目的物而不用于沉淀目的物. .4、复合沉淀法：复合沉淀法：有些多聚电解质可以在极低浓度有些多聚电解质可以在极低浓度下选择性地与某些酶结合而形成沉淀。如聚丙烯下选择性地与某些酶结合而形成沉淀。如聚丙烯酸（酸（PAA）可以与某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯可以与某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分离过程如下：酶等形成沉淀。分离过程如下： PAA+酶酶 PAA-酶酶 PAA-酶酶+Ca 2+ PAA- Ca 2+ + 酶酶 PAA- C

34、a 2+ + SO4 2- CaSO4 + PAA5 选择性沉淀法选择性沉淀法 1 1）常速离心机）常速离心机q又称低速离心机又称低速离心机q最大转速：最大转速：8000r/min 主要用途：分离细胞、细胞碎片、培养基主要用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣等固形物及粗结晶等较大的颗粒。残渣等固形物及粗结晶等较大的颗粒。 （二）离心分离（二）离心分离（1 1）离心机的选择）离心机的选择2 2）高速离心机）高速离心机转速：转速：11042.5104 r/min主要用途：分离各种沉淀物、细胞碎主要用途：分离各种沉淀物、细胞碎片、较大的细胞器等片、较大的细胞器等高速冷冻离心机高速冷冻离心机3 3）超

35、速离心机）超速离心机转速：转速：2.510412104 r/min主要用途：分离主要用途：分离DNA、RNA、蛋白质等生物大分子蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化。以及细胞器、病毒等的分离纯化。超速离心机的精密相当高。为了防止样品液油出，一超速离心机的精密相当高。为了防止样品液油出，一般附有离心帽；为了防止温度升高，均有冷冻装置和般附有离心帽；为了防止温度升高，均有冷冻装置和温度控制系统；为了减少空气阻力和摩擦，设置有真温度控制系统；为了减少空气阻力和摩擦，设置有真空系统。此外还有一系列安全保护系统、制动系统及空系统。此外还有一系列安全保护系统、制动系统及指示仪表等。指示仪表等。原

36、理原理：采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速：采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法，称为差速离心法。度的颗粒分批分离的方法，称为差速离心法。当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在大离心力的条件下进行离心，又得到第二部分较清液在大离心力的条件下进行离心，又得到第二部分较大、较重颗粒的大、较重颗粒的“沉淀沉淀”，如此，多次离心处理，即能，如此，多次离心处理，即能把液体中的不同沉降速度的颗粒分批分离出来。把液体中

37、的不同沉降速度的颗粒分批分离出来。常用于分离大小和密度相差较大的颗粒常用于分离大小和密度相差较大的颗粒。1 1）差速离心法）差速离心法（2 2）离心方法的选用）离心方法的选用2 2）密度梯度离心）密度梯度离心原理：样品在密度梯度介质中进行离心，原理：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。区带分离方法。 梯度介质选择标准：梯度介质选择标准：应具有足够大的溶解度，以形成所需的密度梯度范围；应具有足够大的溶解度，以形成所需的密度梯度范围；不与样品不与样品 中的组分发生反应；中的组分发生反应；不会引起样品中组分的凝集、变性或失活

38、。不会引起样品中组分的凝集、变性或失活。q常用介质：蔗糖、甘油常用介质：蔗糖、甘油q蔗糖：浓度蔗糖：浓度5%5%-60%-60%，密度，密度1.021.02-1.30g/cm-1.30g/cm2 23 3）等密度梯度离心）等密度梯度离心 当预分离的不同颗粒的密度范围处于离心当预分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内时，每种蛋白质颗粒沉介质的密度范围内时，每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管成独立的区带。分成区带的样品可以在管底

39、刺一个小孔逐滴放出，分步收集。底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。超速离心机按照其用途可以分为超速离心机按照其用途可以分为制备制备用超速离心机用超速离心机、分析用超速离心机分析用超速离心机和和分析分析- -制备两用超速离心机制备两用超速离心机3 3种种 蛋白质蛋白质分子在分子在离心离心時，時，其其 分子量、分子密度分子量、分子密度、组成组成、形形状状 等，均等，均会会影响影响其沉降速率，其沉降速率，沉降沉降係係系数系数 即用來描述此沉即用來描述此沉降降性质性质； 其其单位为单位为 S (Svedberg unit)。每一每一种种的沉降的沉降系数与系数与其其分子密度或分子量成正分子密度或分子量成正比

40、。比。 不同沉降不同沉降系数系数的的蛋蛋白质白质，可利用超高速，可利用超高速离离心心法，在密度梯度中作法，在密度梯度中作分離。分離。（3）离心条件的选择）离心条件的选择1）离心力）离心力2）离心时间）离心时间3）温度和）温度和pH（三）过滤与膜分离（三）过滤与膜分离过滤是借助于过滤是借助于过滤介质过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。过滤过滤非膜过

41、滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质 过滤的分类及其特性过滤的分类及其特性( (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) ) 类别类别截留颗粒大小截留颗粒大小截留的主要物质截留的主要物质过滤介质过滤介质粗滤粗滤 2m 2m酵母、霉菌、动物细胞酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金多孔陶瓷、烧结金属等属等微滤微滤0.20.22m2m细菌、灰尘等细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷微滤膜、微

42、孔陶瓷超滤超滤20200.2m0.2m病毒、生物大分子等病毒、生物大分子等超滤膜超滤膜反渗透反渗透 2020 (40,000) 压力差，压力差，100kPa 筛分筛分 超滤超滤UF 120 (10,000-40,000) 压力差，压力差，100kPa 筛分筛分 纳滤纳滤NF 1 (1001000) 压力差，压力差，100) 压力差，压力差，1000kPa 优先吸附、溶解优先吸附、溶解扩散扩散 四种常用膜分离技术的基本特征四种常用膜分离技术的基本特征 加压膜分离：微滤加压膜分离：微滤 超滤超滤 反渗透反渗透 电场膜分离：电渗析电场膜分离：电渗析 离子交换膜电渗析离子交换膜电渗析 扩散膜分离：透析

43、扩散膜分离：透析1）透）透 析析(Dialysis)法：法：4过程过程：4透析袋类型透析袋类型： 再生纤维素膜透析袋和纤维素酯透析袋再生纤维素膜透析袋和纤维素酯透析袋。4透析袋的预处理透析袋的预处理： 1 1、用前只要浸泡湿润和蒸馏水洗涤即可使用、用前只要浸泡湿润和蒸馏水洗涤即可使用 2 2、必要时可用、必要时可用1010mmolmmol/L /L 碳酸氢钠，碳酸氢钠，50%50%乙醇和乙醇和1010mmolmmol/L/L EDTA EDTA处理后，再用蒸馏水洗涤。处理后，再用蒸馏水洗涤。2）超过滤）超过滤(Ultrafiltration)法：法： 利用压力或离心力强行使溶质按大小形状利用压

44、力或离心力强行使溶质按大小形状的差异分开，将所需的酶分子被滤膜截留，的差异分开，将所需的酶分子被滤膜截留，而其它较小的分子随溶剂被压到膜的另一侧。而其它较小的分子随溶剂被压到膜的另一侧。超滤膜：超滤膜：制备超滤膜的材料多是高分子聚合物制备超滤膜的材料多是高分子聚合物 （如聚砜类，聚四氟乙烯等）。（如聚砜类，聚四氟乙烯等）。透析袋酶溶液蒸馏水加压酶溶液超滤膜支持栅板超滤液图3-1 透析装置图3-2 超滤装置（四）层析分离（四）层析分离 利用混合液中各组分的物理化学性质的利用混合液中各组分的物理化学性质的不同，使各组分以不同比例分部布在两相不同，使各组分以不同比例分部布在两相中中固定相和流动相。当

45、流动相流经固定固定相和流动相。当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。不同的组分分离纯化。 层析方法：层析方法：吸附层析、分配层析、离子吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、层析聚交换层析、凝胶层析、亲和层析、层析聚焦焦层析分离方法层析分离方法 层析方法层析方法分离依据分离依据吸附层析吸附层析利用吸附剂对不同物质的利用吸附剂对不同物质的吸附力吸附力不同而使混合不同而使混合物中各组分分离物中各组分分离分配层析分配层析利用各组分在两相中的利用各组分在两相中的分配系数分配系数不同，而使各不同，而使各组分分离组分分离离

46、子交换层析离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的对各种离子的亲和力亲和力不同而达到分离目的不同而达到分离目的凝胶层析凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的各种组分的相对分子质量相对分子质量不同而达到物质分离不同而达到物质分离亲和层析亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可专一而又可逆的亲和力逆的亲和力，使生物分子分离纯化，使生物分子分离纯化层析聚焦层析聚焦将酶等两性物质的将酶等两性物质的等电点特性等电点特性与离子交换层析与离子交换层

47、析的特性结合在一起，实现组分分离的特性结合在一起，实现组分分离吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。价格低廉、可再生，吸附设备简单。吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成装在吸附柱中，装置成吸附层析柱吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入

48、吸附层析柱后，再加当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。附、再解吸、再吸附的过程。 （1）吸附层析：）吸附层析： 1）原理：）原理： 2 2）洗脱方法：溶剂洗脱法）洗脱方法：溶剂洗脱法 置换洗脱法置换洗脱法 前缘洗脱法前缘洗脱法 3 3）吸附剂、洗脱剂的选择）吸附剂、洗脱剂的选择4 4）分类：）分类：根据吸附机制的不同可分为根据吸附机制的不同可分为2 2种：种：物理吸附物理吸附 法，羟基磷灰石法法，羟基磷灰石法；都是利用样品中不同分子与吸附剂之间的吸都是利用样品中不同分

49、子与吸附剂之间的吸附和解吸性质不同而达到分离的目的；附和解吸性质不同而达到分离的目的；操作过程包括：吸附剂的平衡与活化，加样操作过程包括：吸附剂的平衡与活化，加样吸附，洗涤和洗脱。吸附，洗涤和洗脱。 物理吸附法：物理吸附法：常用的吸附剂有硅藻土，活性氧常用的吸附剂有硅藻土，活性氧化铝，淀粉和活性炭等；预先洗涤和活化后，在化铝，淀粉和活性炭等；预先洗涤和活化后，在低盐，弱酸或近中性条件下加样吸附，再在弱碱低盐，弱酸或近中性条件下加样吸附，再在弱碱条件下进行洗脱。条件下进行洗脱。 羟基磷灰石法：羟基磷灰石法：羟基磷灰石是一种微晶型磷酸羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙；一般认为其表面的钙离子和磷酸根离子

50、与蛋钙；一般认为其表面的钙离子和磷酸根离子与蛋白质带相反电荷的基团发生相互作用；也是在低白质带相反电荷的基团发生相互作用；也是在低盐和弱酸或中性条件下进行吸附盐和弱酸或中性条件下进行吸附 ；洗脱时提高；洗脱时提高离子强度。离子强度。（2）分配层析）分配层析 1）定义：）定义：分配层析是利用各组分在两相中的分配分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。系数不同，而使各组分分离的方法。 2）分配系数：）分配系数：是指一种溶质在两种互不相溶的溶是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件

51、确定后，层析系数是一常度的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数。数。 3）种类：纸上层析）种类：纸上层析 薄层层析薄层层析 气相层析气相层析 （3 3）离子交换层析）离子交换层析 利用带电荷的离子交换剂为载体，将带相反电荷利用带电荷的离子交换剂为载体，将带相反电荷的蛋白质吸附，然后在一定条件下洗脱下来。的蛋白质吸附，然后在一定条件下洗脱下来。 离子交换剂离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。若干可解离基团（活性基团）而制成。 按活性基团的

52、性质不同，离子交换剂可以分为按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳阳离子交换剂离子交换剂和和阴离子交换剂阴离子交换剂。 过程：离子交换剂的预处理及平衡、装柱及加样过程：离子交换剂的预处理及平衡、装柱及加样吸附、洗脱、洗脱液收集与相应检测、离子交换吸附、洗脱、洗脱液收集与相应检测、离子交换剂的再生。剂的再生。离子交换剂类型的选择：离子交换剂类型的选择：应考虑以下几个因素：应考虑以下几个因素：参考电泳结果：参考电泳结果：在中性或偏碱性条件下进行电泳，向阳在中性或偏碱性条件下进行电泳，向阳极移动较快的酶，可选用阴离子交换剂；向阴极移动较极移动较快的酶，可选用阴离子交换剂；向阴极移动较快的酶可被阳

53、离子交换剂吸附。快的酶可被阳离子交换剂吸附。待分离酶的稳定性：待分离酶的稳定性：待分离酶如果在低于待分离酶如果在低于pI的条件下稳的条件下稳定，则选用阳离子交换剂；待分离酶如果在高于定，则选用阳离子交换剂；待分离酶如果在高于pI的条的条件下稳定，则选用阴离子交换剂。件下稳定，则选用阴离子交换剂。待分离酶的待分离酶的pI： pI9时选时选用阳离子交换剂；用阳离子交换剂； pI在在6-9之间选用阳性和阴性均可。之间选用阳性和阴性均可。 1、原理、原理：是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到动相中所含各种组分的相对分子质量不同而

54、达到物质分离的一种层析技术。物质分离的一种层析技术。（4）凝胶层析：）凝胶层析： 凝胶层析又称为凝胶层析又称为凝胶过滤凝胶过滤，分子排阻层分子排阻层析析，分子筛层析分子筛层析等。是指以各种多孔凝等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。的一种层析技术。凝胶层析柱中装有凝胶层析柱中装有多孔凝胶多孔凝胶，当含有各，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只

55、能分布于凝胶颗粒的间凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小小分子物质向下移动的速度比大分子的速分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。析柱，而达到分离的目的。2、凝胶的类型与选择、凝胶的类型与选择： 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 Sephadex G: 是

56、葡聚糖微网状是葡聚糖微网状 结构的干胶。结构的干胶。 有有SephadexG-10G-200共共8种型号；种型号；G后面的数字后面的数字表示交联度，数字越大，交联度越小，吸水量越表示交联度，数字越大，交联度越小，吸水量越大，其数值约为吸水量的大，其数值约为吸水量的10倍。倍。琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶: 有有Sepharose, Superose和和 Bio-Gel A三种，每三种，每种又有各种不同的型号；种又有各种不同的型号； 凝胶的孔径大小是通过琼脂糖浓度来控制的；凝胶的孔径大小是通过琼脂糖浓度来控制的； 分级范围很宽；但对温度要求严格（分级范围很宽；但对温度要求严格（2-30），），40以上时

57、易融化，低于以上时易融化，低于0时易堵塞。时易堵塞。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶: 包括凝胶的吸水平衡，装柱，加样，洗脱，流出液，包括凝胶的吸水平衡，装柱，加样，洗脱，流出液，酶活检测和部分收集。酶活检测和部分收集。 层析结果常以洗脱曲线来表示（图层析结果常以洗脱曲线来表示（图2-3），即以洗脱），即以洗脱液中蛋白质含量（液中蛋白质含量（A280）或酶活力对洗脱体积（或酶活力对洗脱体积（Ve)作图。作图。 衡量分离效果的标准是：分辨率高，回收率高，稀衡量分离效果的标准是：分辨率高，回收率高，稀释倍数小，流速快。释倍数小，流速快。 分辨率分辨率Rs = 两峰间距离两峰间距离/峰宽；要求峰宽；要求

58、Rs 1.2； Rs 与与柱长柱长L有关，有关， Rs 与与L 呈正比。呈正比。 3）凝胶柱层析的基本过程与要求）凝胶柱层析的基本过程与要求A2800.40.30.2 0.1酶活力 蛋白质酶活力 800 900 1000 1100 洗脱体积Ve（ml） 图图2-3 凝胶过滤洗脱曲线凝胶过滤洗脱曲线（5）亲和层析法：亲和层析法：定义：定义：亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。化的技术。亲和层析法的四项要素：亲和层析法的四项要素： 固相基质固相基质（solid ma

59、trix） 特异联接的物质特异联接的物质（specific binding substance） 耦合反应耦合反应（coupling reaction） 洗脱洗脱（elution） 亲亲和和层层析法的四析法的四项项要素：要素：(2)SpecificBindingSubstance (B)洗脱Elution(4)配 体Ligand (A)耦合反应 (3)Coupling Reaction杂质BBBB(1)Solid MatrixB亲和层析的核心是亲和层析的核心是亲和吸附剂亲和吸附剂，它是由固相，它是由固相 载体和能与目的酶专一可逆结合的配体共价结载体和能与目的酶专一可逆结合的配体共价结合而成的。

60、合而成的。将亲和吸附剂填充层析柱，让酶液流过层析将亲和吸附剂填充层析柱，让酶液流过层析柱，则目的酶就能迅速而选择性地吸附在亲和柱，则目的酶就能迅速而选择性地吸附在亲和吸附剂上；吸附剂上；用适当的溶液进行洗涤，除去一些非专一性用适当的溶液进行洗涤，除去一些非专一性的杂蛋白后，再用浓度高的或亲和力更强的配的杂蛋白后，再用浓度高的或亲和力更强的配体溶液进行亲和洗脱目的酶便可被洗脱出来。体溶液进行亲和洗脱目的酶便可被洗脱出来。机理：机理： 亲亲和和层层析法的作用析法的作用机机理：理：固相载体(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB亲和基团配体XBAA载体载体配体配体臂臂待分离