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文档简介

1、常用细菌鉴定技术实验目的 掌握细菌的基本鉴定技术细菌的基本鉴定技术 生化反应鉴定:通过观察细菌利用酶和降解糖类、醇类、脂类、蛋白质和氨基酸的能力可以了解其生化活性,从而识别和鉴定细菌。 免疫学鉴定(血清学鉴定) 编码鉴定实验内容生化反应鉴定(每2人一组): 1、糖(苷、醇)利用试验:乳糖分解利用试验 2、氧化酶试验 3、过氧化氢酶试验 4、克氏双糖铁(KIA) 5、半固体(M)(这个实验已做过,本次不做) 6、吲哚试验(I) 7、尿酶试验(U)一、糖(苷、醇)利用试验:乳糖分解利用试验 【原理】 不同的细菌对不同的糖(苷、醇)的分解能力不同,有的分解,有的不能分解,有的分解后能产酸产气,有的分

2、解后仅能产酸,因此可以用来鉴别细菌。 以乳糖分解利用为例,乳糖发酵管中含溴甲酚紫指示剂,当细菌分解乳糖产酸,培养基pH下降,指示剂变黄色,不分解乳糖的指示剂不变色。乳糖分解利用试验 菌种:大肠杆菌、变形杆菌 培养基:乳糖发酵管 方法: 1、取2支乳糖发酵管,用记号笔分别标记大肠杆菌和变形杆菌。 2、按细菌的液体接种法,将大肠杆菌和变形杆菌分别接种到乳糖发酵管中,放入培养箱中培养1824h。乳糖分解利用试验 结果观察 乳糖发酵管中含溴甲酚紫指示剂,当 pH值6.8时呈紫色,pH值5.2时呈黄色,当细菌分解利用乳糖,产酸,使培养基的pH值变小,呈黄色。如细菌不能分解乳糖,则乳糖发酵管仍为紫色。 接

3、种大肠杆菌的乳糖发酵管变为黄色,接种变形杆菌的乳糖发酵管仍是紫色。说明大肠杆菌能够分解乳糖,变形杆菌不能分解乳糖。 乳糖发酵管中如果有小导管,还可以观察产气情况。大肠杆菌能够分解利用乳糖,产酸,产气,小导管中有气泡产生。氧化酶试验 【原理】 氧化酶又称细胞色素氧化酶,能将还原型细胞色素C氧化形成水和氧化型细胞色素C,氧化型细胞色素C再使四甲基对苯二胺氧化,形成显色反应。氧化酶试验 【试剂与器材】 1菌种 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌 2试剂 氧化酶试剂(1%四甲基对苯二胺) 3器材 2cm2cm滤纸片、污物缸氧化酶试验 【操作步骤】 1将滤纸片叠成四方块状。 2用滤纸片的中心尖角小心刮取大肠埃希菌

4、菌落,注意不可碰到培养基。 3轻轻展开滤纸片,刮取的菌落正好在滤纸片中心,滴加一滴1%四甲基对苯二胺。 4立刻观察菌落颜色的变化。 5同法做铜绿假单胞菌的氧化酶试验。氧化酶试验 【结果】 滴加氧化酶试剂后铜绿假单胞菌立刻变为紫色,为氧化酶阳性。大肠埃希菌不变色,为氧化酶阴性。 氧化酶试验(左侧为铜绿假单胞菌、右侧为大肠埃希菌)氧化酶试验 【注意事项】 1实验中的菌种要求新培养的,不宜用陈旧的培养物。 2刮取细菌时不可碰到培养基,不可用接种环等金属物品取菌。 3氧化酶试剂要新鲜配制,一般装在棕色瓶中,放在冰箱中可保存一周,时间长了易被空气氧化变色。 4结果要立刻观察,1min内变色者为阳性,超过

5、1min变色的为阴性。 5在滤纸片上滴加试剂时不要过多,以刚润湿纸片为宜,如滤纸片过湿,可能妨碍空气与细菌接触,延长反应时间,造成假阴性。过氧化氢酶试验 【原理】 过氧化氢酶试验又称触酶试验。部分细菌含有黄素蛋白,在代谢过程中与空气中的氧发生反应,形成过氧化氢,过氧化氢对细菌有毒害作用,会破坏细胞组分,因此,细菌为保护自己,通常具有过氧化氢酶,可以催化裂解过氧化氢,形成水和氧气。过氧化氢酶试验 【试剂与器材】 1、菌种 金黄色葡萄球菌 2、试剂 3%过氧化氢 3、器材 载玻片、无菌移液器吸头、酒精灯、火柴、超净工作台过氧化氢酶试验 【操作步骤】 1、在载玻片中央滴加一滴3%过氧化氢。 2、用无

6、菌移液器吸头蘸取少量细菌,在3%过氧化氢中混匀。 【结果】 观察气泡的产生情况。可以看见在吸头上金黄色葡萄球菌菌苔周围,产生大量气泡,为过氧化氢酶阳性。如果菌苔周围无气泡产生,为过氧化氢酶阴性。过氧化氢酶试验 【注意事项】 1、普通金属接种环可能与过氧化氢反应,形成气泡,造成假阳性,因此必须使用铂丝接种环或塑料、玻璃材质的工具。 2、从血液琼脂平板上挑取菌落时千万小心,不要碰到培养基,因红细胞中有过氧化氢酶,即使一点点也会造成假阳性。 3、过氧化氢试剂现配现用。克氏双糖铁(KIA) 原理:克氏双糖铁(KIA)主要用于革兰阴性杆菌的鉴别,分解乳糖的细菌斜面为黄色,分解葡萄糖的细菌底层为黄色,产生

7、硫化氢的细菌培养基中出现黑色。此外还可以观察细菌分解葡萄糖是否产气。克氏双糖铁(KIA) 【试剂与器材】 1、菌种 大肠埃希菌、变形杆菌 2、器材 克氏双糖铁(KIA)、接种针、酒精灯、火柴、记号笔、试管架、37恒温培养箱,超净工作台。 【操作步骤】 1取2支克氏双糖铁(KIA),用记号笔分别标记大肠埃希菌、变形杆菌。 2按细菌的斜面接种法,将大肠埃希菌、变形杆菌分别接种到相应的管中。 3放入培养箱中培养1824h。克氏双糖铁(KIA) 结果观察:观察上部和下部的颜色变化,变黄为产酸,变红为产碱,有气泡为产气,有黑色为产硫化氢。 大肠杆菌结果:A/A,产气 变形杆菌结果:K/A,产大量硫化氢。

8、吲哚试验【原理】 吲哚试验又称靛基质试验。某些细菌具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚、丙酮酸、氨。加入吲哚试剂对二甲基氨基苯甲醛,与吲哚结合,形成玫瑰色的吲哚化合物。吲哚试验 【试剂与器材】 1菌种 大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌 2试剂 吲哚试剂(对二甲基氨基苯甲醛1g,95%乙醇95ml,浓盐酸20ml配制) 3器材 蛋白胨水培养基、接种针或接种环、酒精灯、火柴、记号笔、试管架、37恒温培养箱,超净工作台。吲哚试验 【操作步骤】 1取2支蛋白胨水培养基,用记号笔分别标记大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。 2按液体接种法,将2菌分别接种于蛋白胨水中。 3置于37恒温培养箱中培养2448h,取出

9、,分别滴加23滴吲哚试剂,轻摇试管,试剂浮于液面,观察颜色变化。吲哚试验 【结果】 接种大肠埃希菌的试验管中,吲哚试剂变成玫瑰红色,为吲哚试验阳性。接种产气肠杆菌的试验管中,吲哚试剂不变色,为吲哚试验阴性。尿酶试验(U) 【原理】 某些细菌可以产生尿酶来水解尿素,可以利用含有尿素的培养基和pH指示剂(如酚红)来检测。尿素被尿酶水解,产生氨、二氧化碳、水,使培养基变碱,酚红变为深粉红色。尿酶试验(U) 【试剂与器材】 1、菌种 大肠埃希菌、普通变形杆菌 2、器材 尿素培养基、接种针或接种环、酒精灯、火柴、记号笔、试管架、37恒温培养箱,超净工作台。尿酶试验(U) 【操作步骤】 1、取2支尿素培养基,用记号笔分别标记大肠埃希菌和普通变形杆菌。 2、按液体接种法,将2菌分别接种于尿素培养基中。 3、置于37恒温培养箱中培养2448h,取出,观察颜色变化。尿酶试验(U) 【结果】 接种大肠埃希菌的试验管为黄色,说明大肠埃希菌不产生尿酶,尿酶试验阴性。接种普通变形杆菌的试验管变为深粉红色,说明普通变形杆菌能产生尿酶,分解尿素,尿酶试验阳性。实验内容生化反应鉴定(每2人一组): 1、糖(苷、醇)利

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