转基因阳性植株的筛选

1、转基因阳性植株的筛选转基因阳性植株的筛选组长组长:刘亚丽刘亚丽刘慧青刘慧青黄西瑞黄西瑞 宁轩宁轩阿米乃阿米乃 古丽孜热古丽孜热第一部分：植物组织基因组 DNA 的提取与鉴定A第二部分：转基因植株 PCR 筛选与鉴定B 学习并掌握植物基因组 DNA 提取的原理与法。实验原理实验原理 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交、RFLP、PCR分离基因和分子标记分析等。利用基因组DNA序列较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，大分子的基因组DNA形成沉淀，而小分子DNA则附于管壁及管底,通过离心方法即可将它们分离，从而达到提取的目的。实

2、验试剂实验试剂51、CTAB 提取缓冲液（100mM Tris-HCL PH=8.0；20mM EDTA；0.5M NaCl；2%CTAB） （1）1MTris-HCL（pH=8.0）：称取 7.85g Tris，加水充分溶解后，再用浓HCl 调节 pH 至 8.0，最终加水定容至 50mL。 （2）0.5M EDTA（pH=8.0）：称取 3.724g EDTA 溶于 15mL 水中，用 NaOH调节 pH 至 8.0，最后加水定容至 20mL。 （3）5M NaCl：称取 14.65g NaCl 加水充分溶解后，最终定容至 50mL（4）分别量取 3mL 1MTris-HCL（pH=8.0

3、）、1.2mL 0.5M EDTA（pH=8.0）、3mL 5M NaCl，充分混匀后，加水定容至 30mL。再称取 0.6gCTAB，121高压蒸汽灭菌 20min。6实验试剂 2、50TAE 缓冲溶液（40mMTris;20mMHAC；1mMEDTA）：称量 12.1g Tris 和1.86g Na2EDTA2H2O，加 30mL 蒸馏水充分搅拌混匀。再加入 2.855mL 冰乙酸，充分混匀后，用 NaOH 调 pH 至 8.5，最终加水定容至 50mL。室温保存。使用时稀释 50 倍，即为 1TAE 电泳缓冲液。3、氯仿:异戊醇=24:1（体积比）：分别量取 24ml 氯仿、1ml 异戊

4、醇，混匀即可。4、异丙醇：现成试剂。5、70%的乙醇：量取 700uL 无水乙醇，加水定容至 1mL。6、溴化乙锭(剧毒)：现成试剂，在暗室存放。7、上样缓冲液：现成试剂。7四、实验步骤四、实验步骤 1 1、植物组织中、植物组织中 DNA DNA 的分离的分离 （1 1）取新鲜的植物）取新鲜的植物 0.1g 0.1g，剪成，剪成 1cm 1cm 左右的小段，倒入液氮充分研磨。左右的小段，倒入液氮充分研磨。 （2 2）待充分研磨后，将粉末全部转移至）待充分研磨后，将粉末全部转移至 1.5mL 1.5mL 离心管中。加入离心管中。加入 0.5mLCTAB 0.5mLCTAB 提提 取缓冲液。取缓冲

5、液。6565水浴水浴 10 10 分钟，期间颠倒分钟，期间颠倒 3 3 次。次。 （3 3）加入）加入 0.5mL 0.5mL 氯仿氯仿: :异戊醇，缓慢颠倒混匀，水浴异戊醇，缓慢颠倒混匀，水浴 5min 5min。 （4 4）10000r/min 10000r/min 离心离心 10min 10min。将上层水相移入另一新的。将上层水相移入另一新的 1.5mL 1.5mL 离心管。离心管。 （5 5）加入）加入 0.7 0.7 倍体积遇冷异丙醇，冰浴倍体积遇冷异丙醇，冰浴 30min 30min。 （6 6）10000r/min 10000r/min 离心离心 10min 10min。弃上清

6、，沉淀用。弃上清，沉淀用 1mL70% 1mL70%乙醇浮洗。乙醇浮洗。 （7 7）弃上清，加入）弃上清，加入 20uL 20uL 蒸馏水溶解沉淀，该溶液即为蒸馏水溶解沉淀，该溶液即为 DNA DNA 溶液。溶液。 2 2、DNA DNA 电泳检测电泳检测 （1 1）制备）制备 1%1%琼脂糖凝胶：称取琼脂糖凝胶：称取 0.2g0.2g 琼脂糖，加入琼脂糖，加入 20mL 120mL 1TAETAE 缓冲液，在缓冲液，在微微 波炉中加热，反复加热，振荡波炉中加热，反复加热，振荡 2-32-3 次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至 6060左左 右，倒入插入梳子的

7、凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。（2 2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样 孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。 （3 3）上样电泳：将）上样电泳：将 5LDNA5LDNA 样品溶液和样品溶液和 2.5L2.5L 上样缓冲液混匀后，上样，上样缓冲液混匀后，上样，60V60V 稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取稳压电泳检

8、查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取 出凝胶。出凝胶。 （4 4）照胶、拍照：将凝胶泡在）照胶、拍照：将凝胶泡在 EBEB 溶液（溶液（* * *EBEB 溶液为剧毒物，需带上一次性手溶液为剧毒物，需带上一次性手 套拿取凝胶）中套拿取凝胶）中 10min10min 左右，进入暗室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。左右，进入暗室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。第二部分 实验目的学习并掌握 PCR 的原理与方法。实验原理PCR定义PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变

9、性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。实验试剂1、dNTP：现成试剂。：现成试剂。2、Taq 酶：现成试剂。酶：现成试剂。3、引物、引物 p5cs1、引物、引物 p5cs2、引物、引物 qs1、引物、引物 qs2：现成试剂。：现成试剂。4、琼脂糖：现成药品。、琼脂糖：现成药品。5、50TAE 电泳缓冲液：称量电泳缓冲液：称量 12.1g Tris 和和 1.86g Na2EDTA2H2O，加，加 30mL蒸馏水充分搅拌混匀。再加入蒸馏水充分搅拌混匀。再加入 2.855mL 冰乙酸，充分混匀后，用冰乙酸，充分混匀后，用 NaOH 调调 pH 至至 8.5，最终加水定容至，最终加水定容至 50mL。室温保存。使用时稀释。室温保存。使用时稀释 50 倍，倍，即为即为 1TAE 电泳缓冲液。电泳缓冲液。6、6上样缓冲液：现成试剂。上样缓冲液：现成试剂。7、DL2000 DNA Marker：庄盟生物，目录号为：庄盟生物，目录号为 ZM404。条带组成为。条带组成为 100bp、 250bp、500bp、750bp、1000bp、1500bp、2000bp。*使用时，彻底化冻使用时，彻底化冻混匀。混匀。实验步骤01（1）反应体系：Buffer 2.5uL、dNTP 0.5uL、引物 1