PCR——聚合酶链式反应

1、掌握掌握PCR实验的基本原理与操作方法实验的基本原理与操作方法理解理解PCR在分子生物实验技术中的重要性在分子生物实验技术中的重要性了解引物设计的一般要求了解引物设计的一般要求基本原理：在体外模拟体内的基本原理：在体外模拟体内的DNA复制复制PCR体系体系模板模板DNA(template)寡核苷酸引物寡核苷酸引物(primer)单脱氧核苷酸单脱氧核苷酸(dNTP)DNA聚合酶聚合酶(polymerase)合适的缓冲液合适的缓冲液(buffer)系统系统目的目的DNA片段在体外高效、快速、特异地扩增。片段在体外高效、快速、特异地扩增。变性变性(denaturation)DNA双链解链变为单链双链

2、解链变为单链退火退火(annealing)DNA复性，引物与模板结合复性，引物与模板结合延伸延伸(extension)引物沿引物沿53端延伸合成新链端延伸合成新链1个循环个循环(cycle)PCR产物的量以指数方式增长产物的量以指数方式增长理论上，理论上，n个循环后，目的个循环后，目的DNA由由1个扩增为个扩增为2n个个Cycle 1Cycle 2Cycle 3210 = 1024 103；220 = 1048576 107；240 10141 mol = 103 mmol = 106 mol = 109 nmol = 1012 pmol 模板模板DNA产物产物DNA10 cycles20 c

3、ycles 40 cycles1 pmol1 nmol10 mol100 molddH2O10PCR反应缓冲液反应缓冲液25 mmol/L MgCl2 4种种dNTP的混合试剂的混合试剂上游引物（上游引物（Forward） 下游引物（下游引物（Reverse）Taq DNA聚合酶聚合酶模板模板DNA(约约1 ng) 50 l35.5 l5 l3 l2 l1 l1 l0.5 l2 l48 l2030cycles预变性预变性变性变性退火退火延伸延伸末次延伸末次延伸94，5 min94，30 sec54，45 sec72，45 sec72，3 min4种种dNTP 必须等浓度配合以减少错配误差。必须

4、等浓度配合以减少错配误差。引物设计基本原则：引物设计基本原则：1、引物与目的片段的序列要紧密互补、引物与目的片段的序列要紧密互补2、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构3、引物不能在模板的非目的位点引发、引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应聚合反应4、长度一般为、长度一般为15-30 bp5、 引物序列的引物序列的GC 含量一般为含量一般为40-60%变性：一般变性：一般9394 1min足以使模板足以使模板DNA变性变性退火退火(复性复性) ：复性温度：复性温度=Tm值值-(510) Tm值值(解链温度解链温度)=4 (G+C)

5、2 (A+T) 复性时间一般为复性时间一般为3060sec延伸：一般选择在延伸：一般选择在7075之间，常用温度为之间，常用温度为72， 延伸速度延伸速度1000bp/min循环：一般的循环次数选在循环：一般的循环次数选在3040。15 l PCR反应产物，加反应产物，加3 l上样缓冲液；上样缓冲液；2%琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶，90120 mA，电泳电泳2040 min；紫外分析仪观察结果。紫外分析仪观察结果。负负 极极正正 极极SamplesMarker (bp)2500150010007505002501001、各种试剂的用量均非常微小，注意微量移液器的、各种试剂的用量均非常微小，注意微量

6、移液器的 使用，避免不当操作造成的误差；使用，避免不当操作造成的误差；2、不要在管壁上做标记，以免影响、不要在管壁上做标记，以免影响PCR仪的导热性仪的导热性3、注意琼脂糖凝胶电泳中、注意琼脂糖凝胶电泳中EB的污染的污染4、所用的、所用的PCR扩增管、枪头都要灭菌。扩增管、枪头都要灭菌。5、每次实验都要设置阴性和阳性对照。、每次实验都要设置阴性和阳性对照。6、根据引物的融解温度设定退火温度，防止出现、根据引物的融解温度设定退火温度，防止出现 非特异性扩增产物。非特异性扩增产物。思考题：思考题：1、以一段、以一段4000bp的的DNA为模板，从中扩增为模板，从中扩增300bp的目的的目的DNA 片段。从第几个循环开始，可以获得目的片段？片段。从第几个循环开始，可以获得目的片段？共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（