非无菌产品微生物检查：微生物计数法综述

1、 中国药典非无菌产品微生物检查：微生物计数法 方法科学性和灵活性：1、方法适用性试验模拟样品污染微生物后进行方法试验性验证。2、结果判定以变化范围进行规定，符合微生物计数规律。3、采用更适宜的培养体系。4、检验结果偏差调查。 修订后的检查法具有以下特点 概念更明确，体例更合理，与国际接轨又兼顾了国情： 增加供试品对照组、 菌种采用CMCC、检验量同2010年版， 微生物限度标准、 控制菌检查了保留部分生化试验。. 计数法明确了中国药典2010年版未规定的事项。计数法合理性、有效性、准确性得以充分体现，结果更接近真实污染状况。如：加菌方式发生变化。与美国、欧洲、日本药典协调后方法一致，对于采用国

2、际、国内两套体系的生产企业在方法一致的前提下，检测结果具有可比性， 修订后的检查法具有以下特点 ICH协调案是对方法的修订，不是直接转换ICH的方法。 修订依据 格式变化 通用要求 计数方法 试验菌液的制备和试验 培养基适用性检查 供试液的制备 计数方法适用性试验 供试品检查 结果判断 主要内容 修订前：一个通则 微生物限度检查法 修订后：三个通则 非无菌产品微生物检查：微生物计数法 非无菌产品微生物检查：控制菌检查法 药品微生物限度标准 标准部分合并一部和二部内容 结果报告问题：【微生物限度】 格式变化 修订前概述检验量供试液制备培养基适用性检查方法验证供试品检查.修订后概述计数方法培养基适

3、用性检查和计数适用性试验供试品检查. 格式变化格式变化修订前检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。修订后用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计，不适用于活菌制剂的检查。检查法可采用替代检查方法，包括自动检测方法，但必须证明其替代方法等效于药典规定的检查方法。 适用范围适用范围 嗜温性微生物： 最适生长温度2543。 腐生微生物：大多数细菌和真菌，从动物、植物或其他有机物吸取养料。 寄生微生物：生活在获得生物体外或体内。 嗜热性微生物： 生长温度为45以上。 嗜冷性微生物： 温度为1018。 污染药品的微生物最普遍的是嗜温性微生物。10 参照ICH的整合修订1、参照ICH协

4、调案”非无菌药品微生物限度检查：微生物计数法”进行的修订。2 、菌数计数在药典一、二、三部附录中内容基本一致。3、增加计数方法4、修订内容 微生物计数定义、培养基及培养基适用性检查、方法验证试验、菌数计数结果判断等内容。（1105）非无菌药品微生物限度检查：微生物计数法 环境的要求环境的要求应在无菌的环境下进行微生物计数的检查，符合微生物计数检查的要求，单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。 微生物计数微生物计数计数方法选择原则根据供试品理化特性和标准等因素进选择。所选方法的供试品量必须充足, 保证试验结果能够判断供试品是

5、否符合规定。所选方法经适用性试验确认。 微生物计数 微生物限度检查指导原则: 供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉 菌和酵母菌总数计数方法； 应选择操作简便、快速的方法。 应避免损伤污染的微生物。 抑菌作用较强的供试品,在供试品溶液性状允许的情况 下，应选薄膜过滤法。 试验菌液的制备和使用 试验菌液制备和使用 应来自认可的国内外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。 使用时应依据中国药典 药品微生物实验规范指导原则的要求。 菌种编号 CMCC 中国医学菌种保藏中心 CMCC（F）真菌 CMCC（B）细菌协调案 ATCC 美国标准菌种收藏中心 NC

6、IMB 英国食品工业与海洋菌种保藏中心 NBRC 日本技术评价研究所生物资源中心 CIP 法国巴斯德研究所菌种保藏中心 菌 株枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis CMCC(B)63501金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CMCC(B)26003铜绿假单胞菌(替代大肠埃希菌） Pseudomonas aeruginosa CMCC(B)10104白色念珠菌 Candida albicans CMCC(F)98001黑曲霉 Aspergillus niger CMCC(F)98003 试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代）

7、。采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 冷冻保藏：长期储藏方法， 一般在低于-30或-70冰箱内保藏 需要加入保护剂，如甘油。冻干法保藏：长期保藏方法 。例如冻干菌种。冷藏： 短期储藏方法。在28的冰箱保藏 。 新鲜菌液制备的菌液基本要求新鲜菌液：微生物保持旺盛的生命活力。切实可行、快速稳定的菌液制备标准程序。采用适宜的保存方法,不可重复从菌种包装瓶中移取菌种或重新冷冻菌种。传代代数（每接种一次即为一代）。 修订前营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基；改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基。 修订后胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤培养基；沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤培养基；马铃

8、薯葡萄糖琼脂 。 新鲜培养物制备用培养基 菌液制备枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤 3035 1824白色念珠菌、沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖液体2025 23天黑曲霉、沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂葡萄糖肉汤2025 57天，或直到获得丰富的孢子 稀释液稀释液修订前 0.9氯化钠溶液 修订后pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 菌液贮存 修订前 修订后 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8可在24小时内使用。 稳定的黑曲孢子悬液可保存在2-8，在验证过的贮存期内使用。 修订前 细菌计数：营养琼脂。霉菌和酵母菌计数：玫瑰红 钠琼脂

9、。酵母菌计数：酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂。 修订后需氧菌总数测定：胰酪大豆胨琼脂和胰酪大胨肉汤（30-35 ）霉菌和酵母菌总数测定：沙氏葡萄糖琼（20-25 ） 、玫瑰红钠琼脂。 培养基 培养基适用性检查目的：确定培养基质量是否符合检验用要求。培养基的无菌性试验培养基的灵敏度试验培养基适用性检查-促生长试验-抑制性试验-指示能力 修订前 培养基培养基细菌、霉菌及酵母菌计数试验菌株试验菌株大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉修订后培养基培养基微生物计数试验菌株试验菌株 铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌黑曲霉 修订前 适用于固体培养基，加菌量50100cf

10、u培养温度 营养琼脂 、营养肉汤 30-35，48h玫瑰红钠：23-8。真菌72h可接受标准 70修订后适用于液体、固体培养基，加菌量不大于100cfu培养温度 胰酪大豆胨琼脂、胰酪大豆胨肉汤 30-35 沙氏葡萄糖琼脂 20-25 好氧菌不超过3天，真菌不超过5天。可接受标准固体培养基: 与对照培养基比较，菌数比值在0.5- 2 (50-200)范围 。液体培养基: 生长良好。胰酪大豆胨肉汤（TSB） 试验用菌株枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌分别接种不大于100cfu试验菌于培养基中，摇匀，培养。接种后，30-35培养不超过3天，应生长良好。注：该培养基同时用于稀释液的制备和控制

11、菌检查时，需要考虑同时满足计数和控制菌检查培养基适用性检查控制要求。 培养基名称胰酪大豆胨琼脂（TSA）无菌性检查取灭菌培养基注入无菌平皿中,30-35培养35天，应无菌落生长。枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、 30-35培养不超过3天白色念珠菌、黑曲霉于20-25培养不超过5天。 涂布法：接种不大于100cfu试验用菌悬液于TSA平板表面；倾注法：接种不大于100cfu试验菌于平皿，注入培养基，摇匀,培养。 与标准培养基比较，菌数比值在0.5-2(50-200)范围内。 沙氏葡萄糖琼脂（玫瑰红钠琼脂）无菌性检查取灭菌培养基注入无菌平皿中,20-25培养57天，应无菌落生长。白色念

12、珠菌、黑曲霉涂布法：分别接种不大于100cfu试验菌于培养基平板上。倾注法：接种大于100cfu试验菌于直径90mm的无菌平皿中,倾注约15ml该培养基，摇匀,培养20-25 , 不超过5天。 判断标准与对照培养基比较，菌数比值在0.5-2(50-200)范围内,且菌落大小、形态一致。注：如用于控制菌白色念珠菌的检查时，同时需要满足控制菌项下培养基适用性检查要求。含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂：培养基适用性检查同沙氏葡萄糖琼脂。 沙氏葡萄糖琼脂+抗生素 取灭菌培养基注入无菌平皿中,20-25培养57天，应无菌落生长。抑菌性检查：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，接种不少于100cfu。促生

13、长能力：白色念珠菌、黑曲霉，接种不大于100cfu，接种不少于100cfu。庆大霉素（G-，G+菌）广谱。氯霉素 （G-菌）广谱。白色念珠菌、黑曲霉于20-25培养不超过5天。与对照培养基比较，菌数比值在0.5-2（50-200）范围内。枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌应不得生长。2022-4-931 计数方法的增修订内容 修订前1、平皿法： 倾注法 2、薄膜过滤法 修订后 1、平皿法： 倾注法（2）涂布法：接种约0.10.2ml供试液，涂布均匀，培养。2、薄膜过滤法3、最大可能数法（MPN）以细菌在胰酪大豆胨液体培养基（TSB）中生长后的浊度比较作判断，精确度较差，仅适用于无适宜方

14、法时的需氧菌总数计数，不适用于霉菌计数。 微生物计数方法倾注法方法 取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中, 注入1520ml温度不超过45熔化的培养基，混匀，凝固，倒置培养。 若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应增加。 涂布法方法 取1520ml温度不超过45的培养基，注入直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养基表面干燥。接种量 不少于0.1ml。适用范围 适宜好氧菌培养。注操作较繁琐，增加污染几率，计数不准确(涂布器会沾少许微生物) 。一次只可加0.10.2ml样品。 薄膜过滤法 滤膜的选择 孔径应不大于0.45m,直径一般为50mm,若采用其他直径的滤膜,冲

15、洗量应进行相应的调整。 滤膜材质应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。 微生物计数方法滤器滤器注意点滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。 微生物计数方法微生物计数方法新增内容 (MPN法)原理：因为细菌在样本中是随机分布的，每个接种管内进入细菌的概率接

16、近于泊松分布。所以检测细菌时，可按照概率理论计数置信度为95%时对应的菌落浓度区间以及置信区间内各菌落浓度的发生概率。局限性：MPN法是一种采用数学理论推算，用置信区间描述菌落浓度的间接计数方法。实验结果以MPN值表示，但MPN值不能表示实际菌落数，实际菌落数在置信区间内的任何一点。 新增内容(MPN法) 其结果是不可信的。MPN法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法.用于微生物计数时精确度较差，尤其是用于霉菌计数，存在结果误判的可能, 本法不适用于霉菌计数。 MPN法更适于微生物污染量较小的供试品。MPN法仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用。 修订前pH7.0无菌氯化钠-

17、蛋白胨缓冲液pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂)或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂） 修订后pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液pH7.2磷酸盐缓冲液胰酪胨大豆肉汤培养基pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂)或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂） 微生物计数稀释液 微生物计数适用性试验 供试品的微生物计数方法适用性试验目的 确认所采用的方法是否适合于该产品的微生物计数。 重新进行适用性试验 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。修订前 计数方法验证修订后 计数方法适用性试验试验菌株修订前细菌用三种菌株进行验证。平皿计数验证时菌液和供

18、试液同时加入平皿，加菌量为50100cfu。 修订后总需氧菌计数用五种菌株试验。菌液加入供试液中，使每mL供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu，且所加菌液的体积不超过供试液体积的1。注：培养时间、可接受标准同培养基适用性检查。计数方法适用性试验计数方法适用性试验试验菌株试验菌株修订前细菌计数：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。（营养琼脂）。霉菌和酵母菌计数：白色念珠菌、黑曲霉。（玫瑰红钠琼脂）。修订后好氧菌总数测定平皿法、薄膜过滤法：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉。（胰酪大豆胨琼脂）。MPN法：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆

19、菌（胰酪大豆胨肉汤）。霉菌和酵母菌总数测定:白色念珠菌、黑曲霉（ 沙氏葡萄糖琼脂）。 适用性试验用菌株接种和稀释根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。每1mL供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。 计数方法适用性试验平皿法平皿法修订前修订前修订后修订后试验组试验组供试液和菌液同时加入平皿中供试液和菌液同时加入平皿中供试液中加入规定量的菌液供试液中加入规定量的菌液, ,使每使每1ml1ml供供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌试

20、液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于量不大于100cfu100cfu。供试品对供试品对照组照组供试液直接加入平皿中（供试液直接加入平皿中（不加不加菌液菌液）供试液，供试液，以稀释液代替菌液以稀释液代替菌液, ,按照试验组按照试验组操作进行试验。操作进行试验。菌液对照菌液对照组组直接加入菌液到平皿中直接加入菌液到平皿中取不含中和剂、灭活剂稀释液加入规定量取不含中和剂、灭活剂稀释液加入规定量的菌液。的菌液。中和剂对中和剂对照组照组稀释剂对照组稀释剂对照组含中和剂、灭活剂的相应稀释液替代供含中和剂、灭活剂的相应稀释液替代供试液按试验组操作加入规定量菌液。试液按试验组操作加入规定量菌液。 供试品检

21、查阴性对照 修订前 平皿法：取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。薄膜过滤法：取试验用稀释液1ml，照上述薄膜过滤法操作不得有菌生长。修订后放在所有检验及验证之前，更为合理。设立阴性对照组;为确认试验条件是否符合要求，以稀释剂代替供试品，阴性对照组应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。 计数方法适用性试验若因供试品抗菌活性或溶解性较差导致所采用的方法不能通过方法适用性试验，应采用适宜的方法对供试液进一步的处理。如果抑制作用仍无法消除，可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再进行方法适应性试验。干扰物干扰物可选用的

22、中和剂或灭活方法可选用的中和剂或灭活方法戊二醛、汞制剂戊二醛、汞制剂亚硫酸氢纳亚硫酸氢纳酚类、乙醇、酚类、乙醇、醛类、醛类、吸附物吸附物稀释法稀释法醛类醛类稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐季铵类化合物（季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸、双胍）、对羟基苯甲酸、双胍类化合物类化合物卵磷脂卵磷脂季铵类化合物（季铵类化合物（QACs）、碘、对羟基苯甲酸）、碘、对羟基苯甲酸聚山梨醇酯聚山梨醇酯水银水银羟基醋酸盐羟基醋酸盐水银、汞化物、醛类水银、汞化物、醛类硫代硫酸盐硫代硫酸盐乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTA）、喹诺酮类抗生素）、喹诺酮类抗生素镁或钙离子镁或钙离子磺胺类磺胺类

23、对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素-内酰胺酶内酰胺酶 删除内容删除内容计数方法适用性试验计数方法适用性试验常见的中和剂或灭活方法常见的中和剂或灭活方法 适用性试验 MPN依据计数法要求制备供试液。将试验菌分别接种供试液中，每 ml含菌量不大于100cfu。按10倍稀释法稀释3个稀释度,每个稀释度3管，共9管,3035 培养，大于3天。菌液对照组 用稀释液替换供试液按以上方法进行操作。 用平皿计数法确定加入试验组及菌液组的菌数，接种量应不大于100cfu。读取试验组和菌液对照组的MPN值，判断试验组的MPN值是否在菌液对照组95%置信区间内，如果是，则方法适用性试验通过，否则

24、需要重新进行优化。 计数方法适用性试验若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致所采用的计数方法不能通过方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试液进行进一步的处理。 计数方法适用性试验抗菌活性的去除或灭活如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方式消除，可经以下方法处理后再进行试验。 增加稀释液或培养基体积. 加入适宜的中和剂或灭活剂。 采用薄膜过滤法。 上述几种方法的联合使用。 计数方法适用性试验抗菌活性的去除或灭活若使用中和剂或灭活剂，试验中应设中和剂或灭活剂对照组。中和剂或灭活剂对照组：取相应量稀释液（浓度同供试液中的中和剂或灭活剂浓度）替代供试液,同试验组操作，以确认其有效性和对微生物

25、无毒性。消除抗菌剂的抑菌活性 可用中和剂或灭活剂，最好在稀释剂或培养基灭菌前加入。中和剂或灭活剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.52范围内。 计数方法适用性试验 结果处理 方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检测。 若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性，那么方法适用性试验中微生物回收的失败可看成是因为供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被微生物污染。 供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。 计数方法适用性试验 结果处理 根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下; 采用能

26、使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法适用性试验。 若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求,那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。 计数方法适用性试验微生物的回收计数方法适用性试验用的各试验菌应逐一进行微生物回收试验 。方法1.平皿计数法:倾注法 、涂布法2.薄膜过滤法3.MPN法 培养条件 细菌：培养温度3035，培养时间不超过3天； 真菌：培养温度2025，培养时间不超过5天。 计数方法适用性试验微生物的回收注意点一、倾注法 1、若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应增加。2、每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果二、涂布法 1、

27、采用适宜的方法使培养基表面干燥。2、 每一平皿表面接种供试液不少于0.1ml。 3、每株试验菌与每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果。 计数方法适用性试验微生物的回收三、薄膜过滤法 1、取相当于1g、1ml或10cm2的供试品, （若供试品中所含的菌数较多时，供试液可酌情减量）加至适量的稀释液中，混匀，过滤。2、用适量的冲洗液冲洗滤膜。3、每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。 微生物的回收MPN法 取供试液按照10倍稀释法稀释，至少3个连续稀释级。取1ml供试液接至910ml胰酪大豆胨肉汤培养基中，每一稀释级各制备3管， 3个稀释度共9管。必要时可在培养基中加入表面活性剂、中和

28、剂或灭活剂。同法测定菌液对照组菌数。同时用平皿法确定试验组及菌液组的接种量。 MPN法 接种管置3035培养3天，逐日观察各管微生物生长情况。结果判断如果由于供试品的原因结果难以判断，将该管培养物转种至胰酪大豆胨肉汤培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基，在相同条件下培养12天，观察是否有微生物生长。根据微生物生长的管数从表3查被测供试品每1g或每1ml中总需氧菌的最可能数（试验组和菌液对照组的MPN值），判断试验组的MPN值是否在菌液对照组95%置信区间内。 结果判断薄膜过滤法或平皿计数法：试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.52范围内。MPN法：试验组菌落数应在稀释

29、剂对照组菌落数的95%置信限内。若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法 及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。方法适用性确认: 若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求,那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。 微生物计数法供试液制备根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。 若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45。从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。若需要，调节供试液pH值至68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。如果供试液制备方法经确认不适用，应建立其他适宜的方法。 微生物计数法供试

30、液制备 修订前液体供试品固体、半固体或黏稠性供试品需用特殊方法制备的供试液的供试品:非水溶性、膜剂、肠溶及结肠溶制剂、气雾剂与喷雾剂、 贴剂， 具抑菌活性的供试品。 修订后水溶性供试品 水不溶性非油脂类供试品 油脂类供试品 。需用特殊方法制备供试液的供试品 ：膜剂、肠溶及结肠溶制剂、气雾剂喷雾剂、贴剂。 微生物计数法供试液制备 修订前 固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆或其他适宜的方法,混匀，作为1 10 的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯 80，并置水浴中适当加温使供 试品分散均匀。修订后水不溶性非油脂类供试品 取供试品。用pH

31、7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨肉汤培养基制备成1:10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释剂中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨使供试品分散均匀。 修订前非水溶性供试品1司盘80、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯80。 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇510分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为110的供试液。 修订后油脂类供试品 取供试品。加入经过滤除菌的十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试

32、品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过40（特殊情况下，最多不超过45），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释剂使成110供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。 修订前气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品,置冰冻室冷冻约1小时。取出,迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液,加至适量的pH70无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分,加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀。取相当于10g或10ml的供试品,再稀释成110的供试液。 修订后气雾

33、剂、喷雾剂供试品 取供试品,置冰冻室冷冻约1小时。取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。取出全部药液于无菌容器中混合，然后取样检查。 供试品检查检验量 修订前1、除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml； 2、膜剂为 100cm2； 3、贵重药品、微量包装药品的检验量可酌减。4、检验时,应从2个以上最小包装单位中取供试品,大蜜丸不得少于4丸,膜剂不得少于4片。5、一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。6、要求检查沙门菌的供试品,其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性

34、对照试验）。 修订后1、除另有规定外,一般供试品的检验量为10g或10ml；2、膜剂为 100cm2；3、贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减；5、检验时,应从2个以上最小包装单位中取供试品,大蜜丸不得少于4丸,膜剂不得少于4片。5、一般应随机抽取供试品，取规定容器数，混合，取规定量供试品进行检验。 供试品检查 修订前 按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液的制备，用稀释液稀释成1:10、1:102、1:103等稀释级的供试液 。修订后按照计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查。 供试品检查培养 修订前计数方法包括平皿法和薄膜过滤法，检查时，按已验证

35、计数方法进行供试品细菌、霉菌和酵母菌数测定。细菌3035培养3天， 霉菌和酵母菌2328培养5天， 必要时可适当延长7天。 修订后按计数方法适用性试验确认计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的测定。胰酪大豆胨琼脂平板在3035培养3-5天沙氏葡萄糖琼脂平板在2025培养57天MPN法和供试品接种，所有试验管在3035 培养35天。 供试品检查计数 修订前 细菌计数:营养琼脂培养基霉菌与酵母菌计数:玫瑰红钠培养基酵母菌计数:酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基修订后需氧菌总数:胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数(包括真菌菌落数)霉菌及酵母菌总数:沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数(包括细

36、菌菌落数)。 供试品检查结果判断 修订前若霉菌与酵母菌、玫瑰红钠上生长营养琼脂上生长细菌，则分别点计霉菌和酵母菌、细菌数。将营养琼脂上霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠上细菌数与玫瑰红钠上霉菌和酵母菌或营养琼脂上细菌数进行比较。以菌落数高的培养基中菌数为计数结果。 修订后若因沙氏葡萄糖琼脂上生长的细菌使霉菌及酵母菌计数结果不符合微生物限度要求,可使用含抗生素(如氯霉素、庆大霉素)的沙氏葡萄糖琼脂中或选择性培养基(如玫瑰红钠琼脂培养基)。使用选择性培养基时,应进行培养基适用性检查。若采用MPN法。测定结果为需氧菌总数2022-4-969 修订前应10cfu 、 100cfu 、 1000cfu 、10000cfu若供试品的细菌数、霉菌数和酵母菌数其中任何一项