蛋白质分子基础蛋白质一级结构测定

1、蛋白质一级结构的测定第1页/共59页序列测定的基本方法学 将肽段用不同方法专一性地切断,将得到的肽段分离纯化之后,分别测出各自的序列。再将不同方法得到的序列进行比对，就可以得到肽链的一级结构。第2页/共59页序列测定一般步骤纯度要求:纯度在97%以上。 双向电泳；凝胶电泳；N-末端测定；纯化至恒定酶活； 肽谱分析。分子量测定多肽链的组成，二硫键的断裂。蛋白质的氨基酸的组成。蛋白质的配基蛋白质的端基分析进行正常的序列测定*-SH，-S-S-+HCOOOH-SO3H第3页/共59页蛋白质和肽的氨基酸组成第4页/共59页蛋白质的水解酸水解酸水解 6 mol/L6 mol/L的盐酸或的盐酸或4 mol

2、/L4 mol/L的硫酸的硫酸,105-110,105-110水解水解2020小时。小时。 优点优点: :不容易引起水解产物的消旋化。不容易引起水解产物的消旋化。 缺点缺点: :TrpTrp被沸酸完全破坏；被沸酸完全破坏； 有有-OH-OH的的Ser或或ThrThr小部分被分解；小部分被分解； AsnAsn和和GlnGln侧链的酰胺基侧链的酰胺基-COOH-COOH。注注: :加入加入0.1-1%0.1-1%巯基乙醇和巯基乙醇和0.05-0.1%0.05-0.1%苯酚苯酚, , Tyr或或ThrThr收率提高收率提高第5页/共59页碱水解碱水解 5 mol/L5 mol/L氢氧化钠煮沸氢氧化钠

3、煮沸10-2010-20小时。小时。 缺点缺点: : 水解过程中许多水解过程中许多AAAA都受到不同程度的破坏，产都受到不同程度的破坏，产率不高。率不高。 水解水解产物发生消旋化产物发生消旋化。 优点优点: :TrpTrp在水解中不受破坏。在水解中不受破坏。第6页/共59页磺酸水解磺酸水解4mol/L4mol/L甲基氨酸甲基氨酸( (含含0.2%0.2%- -吲哚乙胺吲哚乙胺) )色氨酸色氨酸可回收可回收90%90%以上以上, ,SerSer与与ThrThr的回收接近定量值。的回收接近定量值。用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸钠氧化，得到酸钠氧化

4、，得到S-S-磺基半胱氨酸再测定。磺基半胱氨酸再测定。缺点缺点: : 水解环境需中性，条件苛刻。水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易被破坏。被破坏。优点优点: :中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。第7页/共59页磺酸水解磺酸水解4mol/L4mol/L甲基氨酸甲基氨酸( (含含0.2%0.2%- -吲哚乙胺吲哚乙胺) )色氨酸色氨酸可回收可回收90%90%以上以上, ,SerSer与与ThrThr的回收接近定量值。的回收接近定量值。用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫用二硫苏糖醇还原胱氨

5、酸，再用过量的连四硫酸钠氧化，得到酸钠氧化，得到S-S-磺基半胱氨酸再测定。磺基半胱氨酸再测定。缺点缺点: : 水解环境需中性，条件苛刻。水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易被破坏。被破坏。优点优点: :中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。第8页/共59页蛋白质的水解酶的水解酶的水解选用专一性低、水解酶活力高的蛋白酶水解，选用专一性低、水解酶活力高的蛋白酶水解，可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。优点：优点： 其他水解不稳定的氨基酸，如其他水解不稳定的氨基酸，如Tr

6、pTrp、AsnAsn、GlnGln等，都等，都可以用此方法。可以用此方法。缺点：缺点： 不容易彻底水解，也许回收率。不容易彻底水解，也许回收率。 蛋白酶自身溶解的产物也会污染水解的氨基酸混合物。蛋白酶自身溶解的产物也会污染水解的氨基酸混合物。第9页/共59页氨基酸的分离与含量测定第10页/共59页第11页/共59页特殊氨基酸的测定第12页/共59页色氨酸的测定 紫外吸收法 Trp与Tyr在280nm附近的光吸收成一定比例，可用方程计算出Trp的含量： 对二甲基氨基苯甲醛法 Trp在强酸条件下可与醛反应，产物在590nm下有最大吸收。此吸收值与Trp含量成正比。可用此法测量Trp含量。TyrT

7、rp(A280Trp*4815)(A288Trp*5690)(A280Tyr*385)(A288Tyr*1280)第13页/共59页巯基含量测定DTNB法(5.5-二硫代双(-2-硝基苯甲酸) 反应产物(CNT)在412nm处可产生光吸收，根据光吸收值可以相应地计算出巯基的含量。Protein- +R-S-S-R(DTNB)Protein-SHProtein-S-S-R+RS-Protein-S-S-Protein+RS-(CNT)-NO2-COOH-R第14页/共59页末端氨基酸的测定第15页/共59页N-末端的测定 sanger反应 Edman反应 丹磺酰氯(DNS)法 氨肽酶法第16页/

8、共59页O2NFN O2+ H2N C H CR OH N C H CR OO2NN O2H+H2OO2NN O2H N C H CR OO H+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸第17页/共59页SNHCNHOCR1CHN CSNH CH COR2NCH COR1HHNHS:CCH COR1HNNH CH COR2NH2C H COR2NCOCHNHSCR1+第18页/共59页苯异硫氰酸酯（PITC）法：多肽 or 蛋白质末端NH2PITCPTC多肽 or 蛋白质有机溶剂N末端的PTCAA发生环化生成苯乙内酰硫脲的衍生物脱离肽链除去N末端AA后剩下的肽链仍然是完整的。（因为

9、，PTC的引入，只使第一个肽键稳定性降低）干燥 /薄层 气相 HPLC层析 色谱第19页/共59页第20页/共59页封闭的N末端的测定第21页/共59页 末端为Gln的蛋白质发生环化反应，生成焦谷氨酸酰基衍生物，此衍生物可用焦谷氨酸特异性地裂解焦谷氨酰N末端，释放出少一个Gln的肽。 释放的肽可用Edman等方法等正常方法测定。 N端甲酰基可通过温和酸水解除去，活用甲酰基酶除掉。封闭的N端测序第22页/共59页第23页/共59页第24页/共59页第25页/共59页第26页/共59页第27页/共59页第28页/共59页第29页/共59页第30页/共59页第31页/共59页第32页/共59页第33

10、页/共59页第34页/共59页第35页/共59页C C末端分析末端分析 a)a)肼解法肼解法 b)b)还原法：硼氢化锂还原剂还原法：硼氢化锂还原剂 c)c)羧肽酶法（最有效、常用）羧肽酶法（最有效、常用）第36页/共59页第37页/共59页还原法肽链C末端AA硼氢化锂氨基醇水解 C末端氨基酸+ 氨基醇 色谱法鉴定第38页/共59页羧肽酶法羧肽酶法 羧肽酶法：最有效，最常用的测C端殘基方法性质：肽链外切酶，专一地从肽链的C端逐个降解，释放出游离AA。 常用4种羧肽酶：A胰脏 能释放除Pro,Arg,Lys之外所有C末端殘基B胰脏 只能水解以碱性AA,Arg,Lys为C末端的肽键C柑桔中Y面包酵母

11、 第39页/共59页第40页/共59页肽链的专一性水解及肽片段的分离纯化第41页/共59页化学裂解法 溴化氰断裂 羟胺断裂 第42页/共59页第43页/共59页 第44页/共59页酶解法酶解法: :胰蛋白酶胰蛋白酶 R R1 1=Lys=Lys、Arg RArg R2 2=Pro=Pro（抑制水解抑制水解）糜蛋白酶糜蛋白酶 R R1 1=Phe=Phe、TrpTrp、TyrTyr；LeuLeu、MetMet、HisHis胃蛋白酶胃蛋白酶 R R1 1和和/ /或或 R R2 2 = Phe= Phe、 Leu Leu 、Trp Trp 、TyrTyr以及以及 其他疏水残基其他疏水残基嗜热菌蛋白

12、酶嗜热菌蛋白酶 R R2 2 = Leu = Leu 、IleIle、 PhePhe、ValVal、 TrpTrp、 TyrTyr、Met Met 第45页/共59页所得混合肽段可通过凝胶过滤、凝胶电泳、离子所得混合肽段可通过凝胶过滤、凝胶电泳、离子交换柱层析、交换柱层析、HPLCHPLC等方法分离纯化，再进行下面等方法分离纯化，再进行下面的测序等操作。的测序等操作。第46页/共59页肽段的AA顺序测定第47页/共59页Edman化学降解法第一步：偶联反应第48页/共59页Edman化学降解法第二步：环化断裂反应第49页/共59页Edman化学降解法第三步：转化反应第50页/共59页其他测定蛋

13、白质氨基酸序列的方法 酶解法 氨肽酶 羧肽酶 质谱法 由核酸推断蛋白质序列第51页/共59页肽段在多肽链中次序的决定第52页/共59页肽谱重迭法 从不同方法断裂所得到的肽段中重叠的部分着手，得到肽的氨基酸序列。第53页/共59页实例 有一个十肽，N末端及C末端已事先测定分别为Ala及Val 。 糜蛋白酶水解Ala Phe+Gly Lys AsnTyr+ArgTrp+HisVal 胰蛋白酶水解 Ala PheGly Lys +AsaTyrArg+TrpHisVal 因此，得到蛋白质的序列为：Ala PheGly Lys AsnTyrArgTrpHisVal 第54页/共59页二硫键的确定第55页

14、/共59页蛋白质用胃蛋白酶充分处理 点样、滤纸中央 PH6.5 第一向电流 肽段按大小及电荷分开 滤纸暴露在过甲酸蒸汽中（SS断裂） 含二硫键肽段被氧化成氧化成 一对含半胱氨磺酸的肽 滤纸旋转90PH6.5第二向电流 含半胱氨磺酸的成对肽段负电荷 偏离对角线 茚三酮 AA顺序分析确定二硫键的位置 第56页/共59页第57页/共59页由下列信息求八肽的序列。（a）酸水解得 Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val（b）Sanger试剂处理得DNP-Ala。（c）胰蛋白酶处理得Ala，Arg，Thr 和 Leu，Met，Phe，2Val。当以Sanger试剂处理时分别得到DNP-A

15、la和DNP-Val。（d）溴化氰处理得 Ala，Arg，高丝氨酸内酯，Thr，2Val，和 Leu，Phe，当用Sanger试剂处理时，分别得DNP-Ala和DNP-Leu。答：Ala-Thr-Arg-Val-Val-Met-Leu-Phe 第58页/共59页一个含有13个氨基酸残基的十三肽的氨基酸组成为：Ala, Arg,2 Asp, 2Glu, 3Gly, Leu, 3Val。部分酸水解后得到以下肽段，其序列由Edman降解确定，试推断原始寡肽的序列。（a）Asp - Glu - Val - Gly - Gly - Glu - Ala（b）Val - Asp - Val - Asp -

16、Glu（c）Val - Asp - Val（d）Glu - Ala -Leu - Gly -Arg（e）Val - Gly - Gly - Glu - Ala - Leu （f）Leu - Gly - Arg 答：该肽链的序列可以通过将肽片段的相同序列重叠排列起来获得整个序列。 第59页/共59页序列测定一般步骤纯度要求:纯度在97%以上。 双向电泳；凝胶电泳；N-末端测定；纯化至恒定酶活； 肽谱分析。分子量测定多肽链的组成，二硫键的断裂。蛋白质的氨基酸的组成。蛋白质的配基蛋白质的端基分析进行正常的序列测定*-SH，-S-S-+HCOOOH-SO3H第3页/共59页磺酸水解磺酸水解4mol/L

17、4mol/L甲基氨酸甲基氨酸( (含含0.2%0.2%- -吲哚乙胺吲哚乙胺) )色氨酸色氨酸可回收可回收90%90%以上以上, ,SerSer与与ThrThr的回收接近定量值。的回收接近定量值。用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸钠氧化，得到酸钠氧化，得到S-S-磺基半胱氨酸再测定。磺基半胱氨酸再测定。缺点缺点: : 水解环境需中性，条件苛刻。水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易被破坏。被破坏。优点优点: :中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。第8页/共59页第11页/共59页巯基含量测定DTNB法(5.5-二硫代双(-2-硝基苯甲酸) 反应产物(CNT)在412nm处可产生光吸收，根据光吸收值可以相应地计算出巯基的含量。Protein- +R-S-S-R(DTNB)Protein-SHProtein-S-S-R+RS-Protein-S-S-Protein+R