WB实验基本步骤

1、实验基本步骤提取细胞蛋白BCA定量I制备蛋白胶（SDS-PAGE交）蛋白样品变性电泳转膜封闭一抗TBST洗涤二抗TBST洗涤显影结果分析试剂配制PBS磷酸盐缓冲溶液1L磷酸二氢钾0.24g磷酸氢二钠1.44g氯化钠8g氯化钾0.2g加入500ml纯水，调PH=7.2定容至1L,高压蒸汽灭菌PBST(PBS+0.05%tt温-20)500mlPBS+0.25ml吐温-20电转液500mlTris1.5g甘氨酸7.2g400ml水溶解加入100ml甲醇，置于4C冰箱预冷电泳液(1X)10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水TBSTBST(TBS+0.05%tt温-20)50mlTBS+45

2、0ml纯水+0.25ml吐温-20封闭液TBST1X+5娴粉40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40C预热WE验1. 一、蛋白样品制备准备：一管细胞，PBS（4C预冷），PMSF（100mM，移液枪（1000ul,10ul）,1.5mlEP管2个，高速冷冻离心机4C预冷于-20C冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液加入1ml4C预冷的PBS（0.01MpH7.27.3）。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4C,8000r离心5min,然后弃去上清。重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。按1ml裂解液加10lPMSF（100mM,摇匀置于冰上。（PMSF摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）在样品

3、中加入300ul含PMSF勺裂解液，吹匀，于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。2. 裂解完后，于4C下12000rpm离心5min。7.将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管中放于一20C保存。二、蛋白含虽的测定（BCA定虽）准备：96孔板，移液枪（1000ul,10ul,200ul）,BCE作液（A+B,50mlEP管，1xPBS,BSA标准液将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一圈的孔最好不用）算好孔数（总的）每孔加200ulBCA工作液（A+B）,（A液：B液=50:1,一般配多些，如60孔，A液12000ul,B液240ul）将样品稀释到一定倍

4、数才能定量，（10倍，20倍，30倍），每孔需要20ul样品（2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍），做三个重复则需要60ul,一般配80ul配蛋白标准样品，将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml，若配200ul的0.5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ulPBS溶液将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到标号的区域，之后在加标准样品的孔内，将孔内溶液用PBS补足到20ul每孔加200ul配好的工作液，平行加，不能上下加，以减少误差将加好的96孔板放在37C下孵育30分钟孵育完后，放在

5、酶标仪轻微震荡3-10s,中速，吸光值595nm,进行比色测定，记录标准曲线及样品吸光值数据后，以蛋白含量（ml）为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线。（R20.98才有用，酶标仪操作：两个箭头图标,1是结果,2是保存）计算蛋白含量（注意定量样品已经稀释了10倍）蛋白质定量标准曲线加样量W12345678/ul01248121620(0.5mg/ml)背景液（PBS/ul2019181612840标准液浓度mg/ml00.0250.050.10.20.30.40.5三、SDEPAGBfe泳配胶（12%,可以提前配好）准备：玻璃板，梳子，AP（解冻，现拿现用），聚丙烯酰胺（4C冰箱冷藏）（1）玻璃

6、板验漏5min（2）按表配置分离胶（3）灌胶，加酒精封压，凝30min（注意不要有气泡）（4）按表配浓缩胶，倒掉酒精，用吸水纸吸去酒精，灌胶，插梳子（注意不要有气泡），凝30min（5）取胶，用水冲洗一下浓缩胶，加少量水放入一次性手套中4C冰箱保存备用样品处理准备：PBS移液枪，1.5mlEP管（1）稀释样品：一般每孔上样5ul，即1mg/ml浓度的样品，测完蛋白含量后，将样品用PB脚释至1mg/ml（注意loadingbuffer的加入也得算入）（2）取出上样样品15ul至1.5ml离心管中，加入6XSDS上样缓冲液3ul至终浓度为1X。（上样总体积一般不超过15l,加样孔的最大限度可加20

7、l样品。）（3）将样品在100C煮5min震荡使蛋白完全变性（注意仪器操作）电泳准备：电泳液500ml（现配），蛋白胶，10ul移液枪（枪头），样品，Marker,冰盒，电泳装置（1）将SDS-PAGE交放入电泳槽中，加足够的电泳液。（短玻璃板面向内，长玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。注意先检漏。）（2）上样。用移液枪贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。）（3）

8、先设置80V,开始电泳，样品漠酚蓝跑至分离胶后增至120V电压，电泳至漠酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。（此时准备好电转液）四、转膜准备：电转液（现配4C冰箱冷藏），镶子，滤纸，PVDF膜（0.45um）,电转装置，冰盒注意：拿滤纸和膜时一定要戴手套或用镶子，因为手上的蛋白会污染膜。1. 在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫滤纸浸入电转液中，PVDF膜在甲醇中润湿成半透明，小心将膜放入4C电转液中平衡至少5min。2. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一

9、起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上（做好标记），用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验

10、室要开门以使空气流通。）将夹子放入转移槽中（电转移时会产热，浆槽放入冰中），要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。一般用100mA转移90min。转完后将膜用1X丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。（准备封闭液）六、免疫反应准备：封闭液，一抗，二抗，TBST1.将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。2. TBST洗4次。每次5分钟。将膜按照目的蛋白所处位置剪切并做好标记，加入相对应的一抗，室温孵育2h或者4C过夜室温下孵育12h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育12h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗4次，每次5min七、显影准备：样品胶片，移液枪(200ul),中枪头，吸水纸，显影液(A+B),薄锡子一抗二抗目的蛋白78kd1lip1:1000兔二抗75kd目的蛋白34kd(iAPDHft参1:5000鼠二抗28kd目的蛋白17kd:；ep151:1000兔二抗1.将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；2.