Chap08 细菌和噬菌体的重组

1、第八章 细菌和噬菌体的重组与连锁8.1 细菌和病毒8.2 细菌的遗传分析8.3 噬菌体的遗传分析遗传学的发展与研究材料密切相关： 性状遗传 植物（豌豆） 细胞遗传 果蝇 分子遗传 细菌和病毒 遗传学从细胞水平发展到分子水平的另一个重要原因是对基因的化学和物理结构的深入了解。真核生物(eukaryote)原核生物(prokaryote) 原核细胞： 没有核膜和明确的核结构，没有细胞器，不进行有丝分裂和减数分裂，只通过简单的裂殖方式增殖。 遗传物质简单 8.1 细菌和病毒细菌和病毒一、细菌（一、细菌（Bacteria）细菌是单细胞原核生物，无性分裂，生长速度快, 周期短, 20分钟一个世代. 易培

2、养. 简单的培养基即可培养. 易突变. 且突变易鉴别.。大肠杆菌大肠杆菌 E.coliE.coli细菌的表现型：细菌的表现型：菌落形态 颜色、大小、边缘状态等营养需求 野生型（prototroph） 营养缺陷型（auxotroph）对药物、噬菌体和其他因素的反应 青霉素（penicillin）：pens penr研究细菌遗传的方法研究细菌遗传必须具备两个条件: 一是具备野生型和突变型的细菌; 二是选择合适的培养基. 不同的培养基用于培养不同类型的细菌.目前培养基的类型主要有以下3种：基本培养基. 用于野生型细菌的培养. 完全培养基. 用于突变型细菌的培养. 补充培养基. 用于具体突变类型的确定

3、. 二、病毒二、病毒 virus 病毒的结构很简单，只有蛋白质外壳和被外壳包裹着的核酸（遗传物质），没有自身进行代谢和分裂所必须的细胞质和细胞器，必须借助宿主细胞的代谢系统才能繁殖自己。所以，病毒都是寄生性的，它们必须生活在活细胞内。病毒按寄主可分为： 动物病毒，植物病毒，细菌病毒。病毒按遗传物质可分： RNA病毒，DNA病毒。噬菌体噬菌体 bacteriophage，phage细菌病毒，是研究得比较清楚的病毒。噬菌体侵染细菌后在均匀生长的细菌培养板上形成噬菌斑（plaque）。根据噬菌斑的形态和生长特点可以鉴别噬菌体。三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性 世代

4、周期短，繁殖世代所需时间短易于管理和进行生物化学分析是单倍体，便于研究基因的突变便于研究基因的精细结构遗传物质比较简单，用于研究基因结构、功能及表达调控机制比较方便。可用作研究高等生物的简单模型。一一、E.coli 接合的发现接合的发现 1946年莱德伯格(Lederberg, J.) 和塔特姆 (Tatum) 发现细菌的接合（conjugation）。 选用E.coli K12的两个突变品系，A品系：met-bio-thr+leu+thi + (甲硫氨酸和生物素缺陷型)B品系：met+bio+thr-leu-thi - (苏氨酸、亮氨酸、维生素B1缺陷型)8.2 细菌的遗传分析 几种推测：

5、营养物质交流？ 两品系细胞通过培养基交换养料两品系细胞通过培养基交换养料 回复突变？ 回复突变率为回复突变率为106 10， 双缺陷型为双缺陷型为1012 1016 杂交？Davis（1950）U型管试验 证实: 原养型菌落的出现, 是两种菌株直接接触后, 发生基因重组造成的. 排除了营养互补及排除了营养互补及转化的可能性。转化的可能性。W.Hayes的实验（1952）菌株A：met-thr+leu+thi + 菌株B：met+thr-leu- thi - 链霉素可以抑制大肠杆菌细胞的分裂，但不杀死细胞。用链霉素处理A菌、不处理B菌，得到原养型10 -7；链霉素不处理A菌、处理B菌，无原养型出

6、现。 解释：基因交流不是交互的，而是单向的。解释：基因交流不是交互的，而是单向的。 A A株株-供体供体( (donor) B) B株株-受体受体( (receptor) ) 二、单向转移与二、单向转移与F因子因子 接合转移DNA的能力是由细胞质中的F因子的存在所决定的，F因子也称为致育因子(fertility factor)或性因子(sex factor).具有F因子的品系记为F+：相当于雄性。不含F因子的品系记为F-：雌性。 细菌接合细菌接合是指通过细胞的直接接触，遗传信息从供体单向转移到受体的过程。F F+ +细菌细菌表面有性伞毛性伞毛（sex pili）细胞质桥或称结合管（conjug

7、ation tube）F F因子的结构因子的结构封闭环状DNA分子,94.5kb质粒质粒（plasmid）: : 染色体外能自主复制的共价、闭合、环状DNA分子,携带着决定细菌某种遗传特性的基因。附加体附加体(episome): 染色体外的遗传因子, 游离存在时可自主复制, 整合到宿主染色体上时则伴随宿主DNA复制,附加体是特殊的质粒，如F因子。F F因子能够以三种状态存在因子能够以三种状态存在： F因子整合进细菌染色体后, 也能传递寄主染色体标记, 因为F可以传递任何与它连锁的DNA.高频重组品系（高频重组品系（Hfr）接合过程示意图接合过程示意图滚环式复制滚环式复制F菌株的特点菌株的特点1

8、、F细菌可以把F因子传给后代。 2、F细菌经吖啶橙处理F因子丢失，也可以自发丢失因子，丢失后不再出现。 3、F不能和F杂交。 4、F和F杂交后代皆为F。Hfr 菌株的形成和转移过程菌株的形成和转移过程: : Hfr菌株的形成及其基因转移菌株的形成及其基因转移部分二倍体：部分二倍体：u 当当Hfr菌的部分染色体进入菌的部分染色体进入F F细胞后，细胞后，F F细胞中就成为部分二倍体（细胞中就成为部分二倍体（partial diploid）或部分合子（）或部分合子（merozygote）。）。u 新转入的新转入的DNA片断称为供体外基因片断称为供体外基因子（子（exogenote），而受体的染色体

9、称），而受体的染色体称为受体内基因子（为受体内基因子（endogenote）。）。 细菌重组的特点：交换发生在受体受体内基因子内基因子和供体外供体外基因子基因子之间. 转移后的细胞是部分二倍体. 只有偶数交换才能产生平衡的重组子。不出现相反的重组子. .因子可以整合到细菌染色体的不同位置上。 .HfrF- ，Hfr使两个菌株杂交后所产生的重组体频率大大增加（104） .HfrF-，因子的传递频率非常低。F-细菌仍然为F- 。 Hfr菌株的特点：菌株的特点：中断杂交实验中断杂交实验目的：证明接合时遗传物质从供体到受体的转移是直线进行的。 设计人:Elie Wollman和Francois Jac

10、ob(1954)三、 中断杂交作图 .把Hfr菌株与F-菌株混合培养； Hfr：strs thr+ leu+ azir tonAr gal+ lac+ F-：strr thr- leu- azis tonAs gal- lac- 中断杂交试验过程：中断杂交试验过程： strr 对链霉素有抗性对链霉素有抗性 azir 对叠氮化对叠氮化钠钠有抗性有抗性 tonAr 对对T T1 1噬菌体有抗性噬菌体有抗性 thr+ leu+ gal+ lac+ 对苏氨酸、亮氨酸、对苏氨酸、亮氨酸、半乳糖和乳糖为原养型半乳糖和乳糖为原养型.培养一定时间取样，把菌液放在搅拌器内搅拌，以中断杂交；.稀释接种到含有链霉素

11、、不含thr、leu的基本培养基上，杀死Hfr菌株与F-菌株；.对形成菌进行影印培养，记录重组子中每一非选择标记出现的时间、出现的频率和持续时间。中断杂交后，中断杂交后，重组体重组体Hfr各性状出现的频率各性状出现的频率大肠杆菌大肠杆菌Hfr strs thr+ leu+ azis tonAs gal+ lac+ F- strr thr- leu- azir tonAr gal- lac-的结果的结果标记基因 转入的时间（min）频 率thr+8100（经选择的）leu+8.5100（经选择的）azis990tonAs1170lac+1840gal+25258分钟时：分钟时：thr+进入F F

12、- -细胞；8.5分钟时：分钟时：leu+进入F F- -细胞。9分钟时分钟时：有少量叠氮叠氮化物抗性化物抗性的菌落，少数azir基因进入F F- -细胞。 . . 11分钟时分钟时：出现抗菌噬抗菌噬体体T1的F-细菌。18和和25分钟时分钟时：分别出现乳糖乳糖和半乳糖利用菌落半乳糖利用菌落，即lac+和gal+进入F F- -细胞。thr、 leu-选择性标记选择性标记根据中断杂交试验绘制的连锁图根据中断杂交试验绘制的连锁图 以基因转移的以基因转移的时间时间作为基因间距离的单位作作为基因间距离的单位作连锁图的方法连锁图的方法-时间单位法。时间单位法。实验说明： 1. Hfr菌株基因是按一定的

13、线性顺序依次进入F-的； 2.离原点愈近，进入愈早，反之则越晚； 3.致育因子最后转移。minF F因子插入的位置及方向因子插入的位置及方向大肠杆菌的染色体是环状的，连锁图不同是由于F因子插入环形染色体的不同位置以及配对方向不同而引起的 。四四 重组作图重组作图 中断杂交实验只能得到距离较远的基因座排序图, 对于距离很近(两基因转移时间间距2 2分钟分钟)的基因座只能由重组率作重组率作图图.每个基因必须以相等的机会被转移, 这时的重组率才能反映相关基因间的距离. 举例，根据中断杂交实验得知lac和ade基因是紧密连锁的，就某些Hfr供体来说，ade是lac之后进入F-受体的。 Hfr lacl

14、ac+ +adeade+ +strstrs s F- laclac- -adeade- -strstrr r完全培养基混合培养60min基本培养基(无腺嘌呤、加链霉素) 能发酵乳糖，紫红色F- - laclac+ +adeade+ +未发生交换不能发酵乳糖，粉红色F- - laclac- -adeade+ +发生交换F- -adeade+ +strstrr r菌落 将重组子菌落影印在EMB培养基上（含乳糖）由于ade进入F-细胞的顺序较lac晚，因此只要ade进入F-细胞，lac也已经进入。如果选出ade+同时也是lac+，说明lac和ade间没有发生过交换。如果是lac-，说明两者之间发生过

15、交换。a 重组体的基因型是lacadeb 重组体的基因型是lacade基因间重组率：基因间重组率：lac-ade lac-ade =laclac- -adeade+ + laclac- -adeade+ + + +laclac+ +adeade+ + 100%=22%1个时间单位(分钟)大约相当于20%的重组率。接合重组不产生交互重组类型，所以用这种方法得出的图距和具有减数分裂生物中所确定的图距不同。带有部分细菌染色体的F因子。F 因子因子 五、性导性导( (sexduction) ) 由F 引入的外源基因与受体染色体基因形成的部分二倍体现象. F F 的特点的特点: F总在同一点整合同一点整

16、合, 在脱离染色体处重新整合后, 仍然是原来的Hfr染色体. 一些F株系可以携带很大一部分细菌染色体(直到1/4). 使用适当的标记, 利用所产生的部分二倍部分二倍体体, 可以做重组研究.性性导导过过程程示示意意图图性性导导过过程程示示意意图图8.3 噬菌体的遗传分析噬菌体的遗传分析烈性噬菌体烈性噬菌体（virulent phages）是使宿主菌发生裂解的噬菌体, 如T噬菌体系列（T1-T7）。 一、烈性噬菌体一、烈性噬菌体二、二、 噬菌体的基因重组噬菌体的基因重组 当两种不同的噬菌体株系共同侵染一种细菌时, 两亲本噬菌体基因组间可能发生重组, 产生重组合. T2噬菌体的两个突变体: r、h

17、r+: 噬菌斑小, 边缘模糊 r : 噬菌斑大, 边缘清晰 h+: 侵染E. coli B/B2, 形成半透明噬菌斑 h : 侵染E. coli B/B2, 形成透明噬菌斑 RF(r-h) = (r+h+ + rh )/总噬菌斑数 亲组合：透明、小半透、大重组合半透、小透明、大杂交杂交每一基因型的每一基因型的%重组率重组率h+r+h+rxhr+hrxh+ra hr+12.034.042.0 12.024.0%h+rb hr+5.932.056.06.412.3%h+rc hr+0.739.059.00.91.6%h+rx hr+出现的噬菌斑数目和求得的重组率再做杂交：rcr+r+rb结果表明:

18、 rcrb的重组值 rbh所以h 应位于rb及rc之间，排列顺序rchrb。由于T2 噬菌体的连锁图是环状的，所以2、3排列都对。三、温和噬菌体温和噬菌体温和噬菌体温和噬菌体（temperate phage）能够溶源化细菌的噬菌体, 如P1、噬菌体。溶源性溶源性（lysogeny）：有些细菌带有某种噬菌体，但并不立即导致溶菌，这种现象称为溶源性。原噬菌体原噬菌体(prophage): 细菌细胞中无感染能力的噬菌体叫原噬菌体。 溶源菌溶源菌(lysogenic bacterium): 含有原噬菌体的细菌, 称为溶源菌,具有产生和释放噬菌体的潜力。 原噬菌体的存在形式：染色体外游离形式存在，增殖与

19、细菌染色体不同步，具有多个拷贝，如P1；整合到细菌染色体上，增殖与细菌染色体同步，如。温和噬菌体侵染细菌后，有两种繁殖周期：溶菌周期（和烈性噬菌体相同）;溶源周期.四、 转导与作图 鼠伤寒沙门氏菌是否有接合现象？产生上述结果的原因:.是否属于恢复突变?高频率出现不可能是回复突变。.是否属于接合、性导?U型管试验防止细胞直接接触.是否属于转化?结果表现为不受DNA酶的影响，排除了由于DNA片断通过滤片经转化实现基因重组可能性。 转导转导(transduction): 以噬菌体为媒介, 将细菌的小片段染色体或基因从一个细菌转移到另一细菌的过程.结论是：这种重组是通过一种过滤性因子(filterab

20、le agent,FA)实现的。之后证明该因子是沙门氏菌的温和噬菌体温和噬菌体P22。1、普遍性转导普遍性转导（Generalized Transduction）: 通过噬菌体能将供体的任何基因转移给受体, 如沙门氏菌的P22、大肠杆菌的P1 。转导颗粒：把细菌染色体片段包装在噬菌体蛋白质外壳内而产生的假噬菌体，其中并不包含噬菌体的遗传物质。 并发转导(cotransduction)：当两个基因相距较近, 以致能为一个噬菌体头部蛋白所包裹, 即可同时转导, 此称并发转导或共并发转导或共转导转导. 两个基因共转导频率越高, 表明连锁越紧密。（1）两因子转导：每次观察两个基因的转导，通过每两个基因

21、间的共转导频率确定基因在染色体上的顺序。例如：a基因和b基因的共转导频率很高，a和c基因的共转导频率也很高，而b和c很少或完全不在一起转导，这三个基因的次序就应为：bac举例检测结果：检测结果： 选择的标记基因选择的标记基因 非选择的标记基因频率非选择的标记基因频率实验实验1 leu1 leu+ + 50% azi 50% azir r ，2% thr2% thr+ + 实验实验2 thr2 thr+ + 3% leu 3% leu+ + ， 0 0 azi azir r实验实验3 thr3 thr+ +leuleu+ + 0% azi 0% azir r实验1表明2种可能排列，实验2，3证明

22、结果：结果：thrthr leu azileu azi（2）三因子转导：只需分析一个实验的结果就可以推出三个基因的次序。例如：供体大肠杆菌具有基因型a+b+c+，受体的基因型为abc。acbacb或或bcabca最少的一类转导体应代表最难于转导的情况，这种转导体是同时发生交换次数最多的一类（四次交换）。转导体的两边应为供体基因，而中间为受体基因。如正确次序为abc，最少转导体应为a+bc+。如果最少的转导体类别为a+b+c，那么这三个基因的正确次序应当是 d: 同一染色体上两个基因间的物理距离; L: 转导DNA片段的平均长度(约为一个噬菌体基因组大小); x: 两个基因并发转导的频率. 通过

23、共转导关系求出两基因之间的物理距离：例题例题：用P1进行普遍性转导, 供体菌是A+B+C ,受体是ABC +, 选择具有A+(不加物质A)的转导子, 然后在100个A+转导子中鉴定其他非选择标记. 所得结果如下: A+B+ C+ 5 A+B+ C19 A+ BC+49 A+ BC27 T = 100问问：确定三基因的排列次序;计算A和B以及A和C的共转导频率及物理图距，假定P1染色体长10m. 解:三基因排列次序为: AC B A+和B+共转导频率: (5+19)/100= 24% A+和C共转导频率: (19+27)/100= 46% d(A-B)= 101(0.24)1/3 = 3.8 m

24、 d(A-C)= 101(0.46)1/3 = 2.3 m2.特异性转导 特异性转导特异性转导(generalized transduction)或局限性转导(restricted transduction)：噬菌体在转导时, 只携带细菌染色体的特定部分。1）.插入插入比如原噬菌体经常插入宿主E. coli染色体gal与bio区段. 异常切离2）.溶菌溶菌正常切离形成带有gal+的噬菌体颗粒, 称为dgal+. ( defective gal+ )是有缺陷的噬菌体，丧失约25%的噬菌体染色体。3）.侵染侵染dgal+整合位点是有缺陷的, 单独侵染细菌时不能整合， 必须与野生型噬菌体(即辅助噬菌

25、体)共侵共侵染染. 用dgal+ 共侵染受体gal时, 有两种结果： 稳定的转导子为稳定的转导子为galgal+ +不稳定的转导子为不稳定的转导子为 dgalgal+ + /galgal- - （1) 大部分会形成双溶源菌 （2)侵染后, 可以见到少数gal+转导细胞转导细胞生长并形成的菌落. 不稳定的转导子为不稳定的转导子为 dgalgal+ + /galgal- - UV溶菌产物中：一半为正常的噬菌体溶菌产物中：一半为正常的噬菌体 ，一半为，一半为 dgalgal+ +转导转导噬菌体噬菌体高频转导（高频转导（HFT，high frequency transduction) 辅助噬菌体辅助噬

26、菌体helper phage辅助缺陷型噬菌体成熟的作用（补充）8.4 细菌的转化与作图 转化转化( (transformation) ): 受体细胞直接吸收裸露的外源DNA并与其自身的遗传物质发生重组, 从而获得外源DNA所携带的遗传信息。一、影响转化的因素：1 转化片段大小:肺炎双球菌的成功转 化，转化DNA片段至少要有800bp， 枯草杆菌最少需要16kb。2 转化片段形态:转化片段必须是双链。3 转化片段浓度：每个细胞摄取的DNA 分子数不超过10个。 4 受体细胞生理状态:感受态。1.1.结合与穿入结合与穿入 二、转化的主要步骤二、转化的主要步骤2.2.未被降解的一条链部分或整个插入受

27、体细未被降解的一条链部分或整个插入受体细胞的胞的DNA中，形成杂合分子。中，形成杂合分子。 3.3.杂合的杂合的DNA经复制可以形成亲代类型和重组类经复制可以形成亲代类型和重组类型的型的DNA, ,导致转化细胞的形成与表达。导致转化细胞的形成与表达。转化时基因重组只发生在供体和受体的同源转化时基因重组只发生在供体和受体的同源区域，同样不存在相反的重组子，而且只有区域，同样不存在相反的重组子，而且只有双交换和偶数次的多交换才能形成重组子。双交换和偶数次的多交换才能形成重组子。三、转化基因间重组值的计算三、转化基因间重组值的计算 转化子数转化子数( (重组体数重组体数) ) 亲组合数亲组合数+ +

28、转化子数转化子数例:枯草杆菌从供体菌（trp2+ his2+ tyr1+）提取DNA向受体菌（trp2- his2- tyr1-）菌株转化，结果见下表 重组率重组率= = = = (+ -)+(- +)(+ -)+(- +)(+ +)+(+ -)+(- +)(+ +)+(+ -)+(- +) 座位座位转化体类别转化体类别t trprp2 2h hisis2 2tyrtyr1 1 + - - - + + + + + - + - - + + + + - - + -11940 3660 685 418 2600 107 1180亲本型 重组型重组型 重组重组率率（+） （+-）和（）和（-+）trp2his2trp2tyr1his2tyr111940+118013120 2600+107+3660+4186785 0.3411940+10712047 2600+1180+3660+6858125 0.4011940+3660 15600 418+1180+685+1072390 0.13例题：转化的供体菌株基因型是a+b+c+, abc, 你预期哪一类转化